蔡輝 蔡佳宇 常文靜 趙智明 董曉蕾 趙凌杰

·論著·

丹參酮ⅡA對(duì)壓力負(fù)荷增加大鼠心肌NF-κB表達(dá)的影響

蔡輝 蔡佳宇 常文靜 趙智明 董曉蕾 趙凌杰

目的 觀察丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)對(duì)壓力負(fù)荷增加大鼠心肌組織核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響，并探討其對(duì)心肌纖維化的保護(hù)作用。方法采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力負(fù)荷心肌纖維化模型，術(shù)后存活32只大鼠隨機(jī)分成4組(n=8)，假手術(shù)組、模型組、TanⅡA組(20 mg·kg-1·d-1)及陽(yáng)性對(duì)照藥物卡托普利組(100 mg·kg-1·d-1)。術(shù)后4周成功造模并開(kāi)始給藥，療程為4周。8周后檢測(cè)左心室重量指數(shù)、心肌組織病理學(xué)、心肌羥脯氨酸含量以及心肌組織NF-κB p65 蛋白含量。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心室治療指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P< 0.01)；與模型組比較，TanⅡA則顯著降低(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌羥脯氨酸含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，TanⅡA組則顯著降低(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NF-κB p65 表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TanⅡA組則顯著降低(P<0.01)。結(jié)論TanⅡA能抑制心肌肥厚，減輕心肌纖維化，此作用可能與部分下調(diào)NF-κB表達(dá)有關(guān)。

丹參酮ⅡA；壓力負(fù)荷；心肌纖維化； 核因子-κB

壓力負(fù)荷增加能激發(fā)心肌短暫的炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，介導(dǎo)心肌纖維化[1]。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥和纖維化反應(yīng)，參與心室重構(gòu)的進(jìn)展[2]。丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的脂溶性有效成分，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療心血管疾病。研究證明，丹參酮ⅡA能有效地抑制大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，延緩心肌纖維化[3，4]，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)建立腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力負(fù)荷增加心肌纖維化模型，在體觀察NF-κB p65蛋白在壓力負(fù)荷增加大鼠心肌中的表達(dá)，以及丹參酮ⅡA對(duì)壓力負(fù)荷增加大鼠心肌纖維化的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)6周齡SD大鼠60只，雄性，體重160～200 g [許可證號(hào)：SYXK(蘇)2003-0032]，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫為(23±3)℃，周期光照8∶00～20∶00，飼料、墊料高壓滅菌，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥品與試劑 丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射劑，2 ml∶10 mg，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；卡托普利片，12.5 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；NF-κB p65一抗，武漢博士德有限公司；DAB 顯色劑、MaxvisionTM購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌纖維化模型制備：采用Anversa等[5]所用方法用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力負(fù)荷心肌纖維化模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，術(shù)前禁食12 h，自由飲水，將手術(shù)組用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常規(guī)備皮消毒后，于劍突下沿腹正中線逐層開(kāi)腹，在腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈上方0.5 cm用內(nèi)徑0.70 mm銀夾夾閉，使腹主動(dòng)脈縮窄60%～70%，確認(rèn)無(wú)出血，將臟器復(fù)位后逐層關(guān)閉腹腔，術(shù)后給予青霉素10萬(wàn)U/kg肌內(nèi)注射抗感染3 d，6 h后恢復(fù)飲食。假手術(shù)組不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，余處理同上，術(shù)后觀察4周。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)(HWI=HW/BW)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVWI=LVW/BW)均明顯升高。

1.3.2 給藥及分組：取術(shù)后存活大鼠32只隨機(jī)分4組，每組8只：假手術(shù)組、模型組(10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)、丹參酮ⅡA組(20 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)及卡托普利組(100 mg·kg-1·d-1，灌胃)。4組每天上午給藥1次，連續(xù)給藥4周，觀察大鼠的飲食、毛色、活動(dòng)、水腫等一般性狀，每周稱(chēng)體重(BW)。

1.3.3 心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定：術(shù)后8周末，禁食12 h，將5組大鼠稱(chēng)重后采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，取血完畢后，迅速開(kāi)胸摘取心臟，于4℃ 0.9%氯化鈉溶液中洗去血液，濾紙吸干，除去心臟周?chē)M織和大血管，稱(chēng)取心臟重量(HW)，再剪去左右心房、右心室游離壁保留左心室及室間隔，稱(chēng)取左心室重量(LVW)。分別計(jì)算心臟重量指數(shù)(HWI=HW/BW)和左心室重量指數(shù)(LVWI=LVW/BW)，以HWI和LVWI作為判斷心肌肥厚的指標(biāo)。透壁剪取左心室心尖部分組織投入液氮中留待檢測(cè)其他指標(biāo)，其余標(biāo)本放于4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.4 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)：心肌標(biāo)本于甲醛中固定24 h后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長(zhǎng)軸線每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張4 μm厚的切片，作HE和Masson染色。光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變及膠原沉積情況。

1.3.5 大鼠心肌組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測(cè)：心肌組織中HYP的含量可用于估測(cè)心肌組織中的膠原水平，即心肌纖維化程度。采用化學(xué)比色法測(cè)定大鼠心肌組織中HYP含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，心肌組織蛋白定量采用改良Lowry’s法。

1.3.6 Maxvision免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓抗原修復(fù)，噴氣后計(jì)時(shí)2 min，自然冷卻，水洗，用PBS沖洗1次，1 min，除去PBS，每張切片滴加50 μl 3% H2O2溶液，室溫下孵育10 min，PBS 沖洗3 次，每次1 min，除去PBS，每張切片滴加50 μl一抗NF-κB p65，37℃孵育1 h，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl MaxvisionTM試劑，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 ul新鮮配制的顯色劑(DAB)，室溫下孵育10 min；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。DAB顯色陽(yáng)性表達(dá)為棕色。每份標(biāo)本隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野(×400倍)，采用Image-pro Plus Version 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以平均光密度(MD)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 術(shù)前60只大鼠，50只大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，造模4周時(shí)，手術(shù)組大鼠有18只死亡，主要死因?yàn)閲?yán)重心力衰竭，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，未再出現(xiàn)大鼠死亡。隨機(jī)選取24只分為3組(n=8)：模型組、丹參酮ⅡA組和卡托普利組。假手術(shù)組存活10只，隨機(jī)選取8只。術(shù)后第1周4組動(dòng)物均精神萎靡，活動(dòng)量減少，毛色暗淡，攝食及飲水減少，1周后好轉(zhuǎn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，假手術(shù)組大鼠一般狀況良好，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，行動(dòng)敏捷，毛色光澤，攝食及飲水正常，與術(shù)前未見(jiàn)明顯差別；模型組大鼠后期精神萎靡，行動(dòng)遲緩，倦臥，毛色逐漸失去光澤；而丹參酮ⅡA組和卡托普利組大鼠的一般狀況較模型組明顯好轉(zhuǎn)。4組大鼠均未出現(xiàn)呼吸困難、水腫、進(jìn)食困難、尿少等心力衰竭癥狀。

2.2 HWI和LVWI結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組的HWI和LVWI均顯著增大(P< 0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組的HWI和LVWI下降均顯著下降(P< 0.01)。見(jiàn)表1。

組別HWILVWI假手術(shù)組2．63±0．132．08±0．11模型組3．23±0．25?2．75±0．20?卡托普利組2．82±0．32#2．29±0．29#丹參酮ⅡA組2．88±0．20#2．36±0．20#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

2.3 心肌組織HE染色結(jié)果 光鏡下觀察可見(jiàn)：假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋明顯，胞核結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)細(xì)胞腫脹，心肌間質(zhì)及微血管結(jié)果正常；模型組大鼠心肌纖維明顯增粗，排列紊亂、部分心肌細(xì)胞水腫、淺染，橫紋模糊，偶見(jiàn)心肌斷裂，肌束間隙呈不同程度增大，胞核固縮，部分出現(xiàn)局灶性、片狀壞死，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；丹參酮ⅡA組和卡托普利組均有不用程度改善。

A: 假手術(shù)組； B: 模型組； C: 卡托普利組； D: 丹參酮ⅡA組；

圖1 4組大鼠心肌HE染色

2.4 心肌羥脯氨酸含量檢測(cè) 造模8周時(shí)，與假手術(shù)組比較，模型組心肌HYP含量水平明顯增高(P<0.01)，提示壓力負(fù)荷增加大鼠心肌膠原總量升高；與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組HYP表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.5 大鼠心肌NF-κB p65蛋白的表達(dá) 造模8周時(shí)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠心肌NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，NF-κB p65蛋白陽(yáng)性成分為棕褐色，在心肌細(xì)胞顯著高表達(dá)，在炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組NF-κB p65蛋白表達(dá)水平增高(P<0.01)。與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組下降更明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖2。

假手術(shù)組 模型組 卡托普利組 丹參酮Ⅱ A組

圖2 4組大鼠心肌NF-κB p65蛋白表達(dá)

組別HYP(μg/g)NF?κBp65(MD)假手術(shù)組457±1250．0812±0．0053模型組758±145?0．0354±0．0066?卡托普利組483±29#0．0443±0．0057#丹參酮ⅡA組521±141#0．0162±0．0062#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01; 與模型組比較，#P<0.01

3 討論

心室重構(gòu)涉及心臟細(xì)胞和間質(zhì)的基因、分子和細(xì)胞的改變，包括心臟擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化以及心臟收縮和舒張功能下降[6]。心臟結(jié)構(gòu)的主要變化是心臟肥厚和心肌纖維化。心臟肥厚的程度與心力衰竭患者的病死率密切相關(guān)。在心室重構(gòu)模型中，HMI是評(píng)估心臟肥厚程度的主要指標(biāo)[6]。在本研究中，用HMI和LVMI顯著增加來(lái)評(píng)估心臟肥厚的程度，而丹參酮ⅡA能顯著減輕心臟肥厚。

在心室重構(gòu)的過(guò)程中，大量的膠原分泌并聚集在心肌間質(zhì)和血管周?chē)?。膠原分泌的增加和聚合導(dǎo)致心肌僵硬度增加、心肌結(jié)構(gòu)的改變、心室重構(gòu)的發(fā)生，并最終導(dǎo)致心室功能障礙[7]。因此，抑制心肌纖維化能改善心臟功能。本研究顯示，丹參酮ⅡA能顯著減輕心肌HYP含量，即心肌膠原含量。因此，我們推測(cè)，丹參酮ⅡA能減少膠原分泌和合成，阻止心肌纖維化，延緩心室重構(gòu)和心力衰竭進(jìn)程。

心肌細(xì)胞壞死激活先天免疫促發(fā)一個(gè)強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致修復(fù)性反應(yīng)。盡管壓力負(fù)荷增加不能導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，但也能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)。神經(jīng)內(nèi)分泌激活通過(guò)活性氧的產(chǎn)生和NF-κB系統(tǒng)的活化直接刺激炎癥反應(yīng)，血管緊張素Ⅱ和醛固酮也可增強(qiáng)NF-κB活性，直接刺激心肌炎癥反應(yīng)，此外，壓力負(fù)荷增加還可通過(guò)活化基質(zhì)金屬蛋改變誘導(dǎo)心肌細(xì)胞外基質(zhì)[8]。

在正常心臟組織中，NF-κB與它特異性抑制劑IκBα結(jié)合，可以防止NF-κB活化，壓力或容量負(fù)荷增加引發(fā)多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激能激活I(lǐng)κBα激酶，進(jìn)而使IκBα磷酸化，從而釋放NF-κB，使NF-κB轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄活性[9]。盡管NF-κB本身并不是激活膠原轉(zhuǎn)錄所必須的，但它能間接增加基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，尤其是明膠酶基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9[10]；NF-κB通路還可上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生與發(fā)展[11]。在本研究中，免疫組化染色顯示，壓力負(fù)荷增加可誘導(dǎo)NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)在心肌和間質(zhì)均有表達(dá)，這提示壓力負(fù)荷增加不僅僅誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)NF-κB，而且心肌間質(zhì)也有表達(dá)；給予TanⅡA 4周后，NF-κB p65蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。這些研究結(jié)果提示，抑制NF-κB p65可顯著減少心肌膠原合成，降低心肌膠原含量，減輕心肌纖維化，進(jìn)而改善壓力負(fù)荷增加大鼠左心室重構(gòu)。因此，我們認(rèn)為丹參酮ⅡA能通過(guò)抑制NF-κB p65的表達(dá)而有效地延緩或防止心肌纖維化的發(fā)生。

綜上所述，NF-κB p65在心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。丹參酮ⅡA可降低心室質(zhì)量指數(shù)和左心室重量指數(shù)，抑制心臟肥厚和心肌間質(zhì)膠原合成，減輕心肌纖維化和心室重塑，改善壓力負(fù)荷大鼠心肌纖維化，其作用可能與部分抑制NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。抑制NF-κB 信號(hào)將為心肌纖維化的防治提供新的途徑。

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EffectoftanshinoneⅡAonexpressionofmyocardialNF-κBinratswithpressureoverload

CAIHui，CAIJiayu，CHANGWenjing,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,GeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of tanshinone ⅡA (Tan Ⅱ A) on expression of myocardial NF-κB in rats with pressure overload,and to explore its protective effects on myocardial fibrosis.MethodsThe pressure overload myocardial fibrosis models were established by abdominal aorta constriction in Sprague-Dawley (SD) rats,these rats were randomly divided into four groups:sham-operation group,model group,Tan Ⅱ A group (20mg·kg-1·d-1) and positive control group (captopril 100mg·kg-1·d-1),with 8 rats in each group.4 weeks after the operation,the animal models were successfully established,then the rats were given drugs,with a course of 4 weeks.After 8 weeks,left ventricular mass index,myocardial tissue pathological changes,myocardial hydroxyproline content,myocardial NF-κB p65 expression were detected in rats of the four groups.ResultsAs compared with those in sham-operation group,cardiac mass index and left ventricular mass index were significantly increased in model group (P<0.01); as compared with those in model group,these indexes were obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with that in sham-operation group,myocardial hydroxyproline content was significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with that in model group,myocardial hydroxyproline content was obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,NF-κB p65 protein expression levels in myocardial tissues were significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with those in model group,which were significantly decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).ConclusionTan Ⅱ A can inhibit cardiac hypertrophy,relieve myocardial fibrosis,and the effect may be related to down-regulation of the expression of NF-κB.

tanshinone ⅡA;pressure overload; myocardial fibrosis; NF-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.006

項(xiàng)目來(lái)源：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金面上課題(編號(hào)：2010Q027)

210002 南京市，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科

R 542.23

A

1002-7386(2014)02-0180-04

2013-09-11)