★ 劉大偉 賴佐發(fā) 廖寶源

(贛州市食品藥品檢驗所 江西 贛州 341000)

筆管草為木賊科植物筆管草EquisetumdebileRoxb.的干燥的地上部分。全年可采，割取地上部分，除去雜質(zhì)，曬干。用于急性結(jié)膜炎，急性黃疸型肝炎，痢疾，尿道炎，蕁麻疹。微苦、甘，平。歸肝經(jīng)。清熱利濕，明目退翳。分布于江西(贛州)、廣東、福建(泉州、廈門、龍巖、三明、南平)等省區(qū)，生于山谷溪邊潮濕地，為江西省贛南地區(qū)民間常用藥[5]。本品收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第九冊(1994年版)，原標準只有簡單的性狀、顯微鑒別和化學(xué)反應(yīng)，未對藥效成分進行定性、定量檢測，難以保障其藥材及其成方制劑的質(zhì)量和臨床用藥的有效性和安全性。[2]因此，本文在筆管草原標準基礎(chǔ)上，建立了水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、山柰素的薄層鑒別和含量測定方法，為筆管草藥材及其成方制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀(VWD檢測器、四元低壓混合泵、柱溫箱、自動進樣器、ChemStation色譜工作站)；DM500攝影攝影顯微鏡(德國萊卡；USC302超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)；GZX-DH-40ⅹ45-BS電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；SX2-5-12 C0149箱式電阻爐(上海實驗儀器廠有限公司)；梅特勒AB265-S型電子天平。

乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。山柰素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110861-200808，含量為95.9%)。10批筆管草藥材為采自贛州市信豐小江(暫定批號為1 -10)，經(jīng)贛州市食品藥品檢驗所劉志輝鑒定為木賊科植物筆管草EquisetumdebileRoxb.的干燥的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 植物來源[5]多年生草本，高18～100cm，硬且粗糙。根莖橫走，黑或黑褐色。莖綠色，直立，直徑2～15mm，中空，基部節(jié)上有2～5分枝，稀無分枝或僅有1小枝，有棱脊6～20條，棱脊上有1列小疣狀突起或小橫紋，溝中有氣孔線1列。葉小，輪生，下部聯(lián)合成鞘筒，疏松地包圍莖節(jié)，鞘片背上無棱脊，鞘齒短三角形，黑色，有易脫落的膜質(zhì)尖尾，孢子束穗生于分枝及主莖頂端，矩圓形，有小尖頭，長0.5～2.5cm，無柄；孢子同型，圓球狀，有長彈絲4，或十字形，平時緊繞在孢子外面，遇水即彈開。孢子成熟8～10月。

2.2 藥材性狀 本品呈長桿狀，長30～50cm，直徑0.2～0.5cm,表面灰綠色或黃綠色，有6～20條棱背，節(jié)明顯，節(jié)間長2～9cm，葉鞘基部和鞘齒黑棕色，鞘齒短三角形，有的可見膜質(zhì)尖尾，每節(jié)輪生枝2～5條。體輕，質(zhì)脆，易折斷，手捻之有粗糙感，斷面中空，內(nèi)表面白色膜質(zhì)。氣微，味淡微甘。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品粉末1g，加75%甲醇25mL，鹽酸1mL，加熱水解1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10mL溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。[1]

2.3.2 對照品溶液的制備 另取山柰素對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 薄層色譜的展開 照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，采用雙槽展開缸,以環(huán)已烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.4)為展開劑，上行展開，展距8～15 cm。

2.3.4 顯色 5%三氯化鋁乙醇溶液，立即置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

1. 山奈素；2～11. 筆管草藥材

2.3.5 樣品檢識 按上述條件對10批土黃連藥材進行薄層色譜鑒別，結(jié)果各斑點分離良好，顯色清晰，且各批藥材薄層鑒別結(jié)果一致性較好。見圖1。

2.4 檢查

2.4.1 水分 按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H第一法測定[8]。見表1。

2.4.2 總灰分 按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K測定。見表1。

2.4.3 酸不溶性灰分 按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K測定。見表1。

2.5 浸出物 用水作溶劑作溶劑，水溶性浸出物測定法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅹ A)項下的熱浸法測定。見表1。

表1 筆管草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量測定結(jié)果

圖2 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的HPLC色譜圖

2.6 含量測定 筆管草主要含山柰素，因此本文采用HPLC法建立了筆管草藥材中山柰素含量測定方法。

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil(鉆石)C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶50)；檢測波長：365nm；進樣量：10μL；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃。理論板數(shù)按山奈素峰計算應(yīng)不低于3000。見圖2。

2.6.2 對照品溶液的制備 取山奈素對照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.6.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.75g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20mL，加鹽酸5mL，置水浴中加熱水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。[1]

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密吸取1.0，2.5，5.0，7.5，10.0μg/mL的山奈素對照品溶液，分別進樣10μL，測定。以進樣量(μg)為橫坐標，山奈素峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=4046.3X-18.885，r=0.9993。結(jié)果表明山奈素在0.00998～0.0998μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.5 精密度試驗 取本品(批號20130116)0.75g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定，重復(fù)6次，計算山奈素RSD=0.46%，表明精密度良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗 取本品(批號20130116)6份，每份0.75g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定，記錄山奈素峰面積并計算RSD=0.54%， 表明方法重復(fù)性良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗 取本品(批號20130116)0.75g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，分別于0，2，4，6，8，12，24h測定，記錄山奈素峰面積并計算RSD=0.38%，結(jié)果表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 山奈素加樣回收率試驗

2.6.8 加樣回收率試驗 取本品(批號20130116)6份，每份0.375g，精密稱定，分別加入0.0125mg/mL的山奈素對照品溶液25mL，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定，計算山奈素的含量及RSD。結(jié)果山奈素的平均回收率為99.82%，RSD=0.14%,表明該方法回收率良好。見表2。

2.6.9 藥材含量測定 取本品細粉約0.75g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件分別測定山柰素的含量，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 實驗考察了供試品溶液的穩(wěn)定性，每隔一定時間點樣一次，在放置0，2，6，24 h內(nèi)點樣，結(jié)果表明：在2 h內(nèi)，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。證明供試品溶液要臨用新配。

3.2 浸出物測定考察 實驗分別采取熱浸法和冷浸法，熱浸法中用水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇分別做溶劑進行考察；冷浸法中用水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇做溶劑進行考察，結(jié)果表明：水作溶劑熱浸浸出率最高。故選取水作溶劑熱浸。

3.3 灰分和酸不溶性灰分測定考察 針對本品灰分和酸不溶性灰分測定值較高，實驗分別采取水洗和加10%硝酸銨溶液濕潤后測定。實驗所用樣品均為干燥的地上部分，考慮到樣品是否已洗凈，如果樣品帶有灰塵和泥沙，均會影響最后的檢測結(jié)果。所以，第一步采取水洗，凈制樣品，并延長炭化時間。水洗過程中，未發(fā)現(xiàn)有塵土和泥沙。樣品的水洗前和水洗后的測定結(jié)果比較接近?？紤]到考慮到樣品炭化后有可能不易灰化，故采取加10%硝酸銨溶液濕潤。具體操作為：當樣品炭化后，放冷，加10%硝酸銨溶液3mL，使殘渣濕潤，置水浴上蒸干，再放進高溫爐內(nèi)進行熾灼，至坩堝內(nèi)容物完全炭化。測定結(jié)果比較接近。因此，灰分和酸不溶性灰分測定值較高是樣品成分原因。

3.4 含量測定

3.4.1 波長選擇 取山柰素對照品適量，用75%甲醇制成適當?shù)臐舛龋?5%甲醇為空白，在400～300nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果在365nm波長處有穩(wěn)定的吸收，同時參考《中國藥典》中山柰素的檢測波長，確定檢測波長為365nm。

3.4.2 流動相的選擇 參考《中國藥典》中山柰素含量測定方法，采用乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動相體系，山柰素與其它組分分離完全，結(jié)果滿意。

[1]國家藥典委員會·中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中醫(yī)醫(yī)藥科技出版社，2010：285-286.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標準﹒中藥成方制劑第九冊[S].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會出版,1996:180-181.

[3]北京市衛(wèi)生局.北京中藥材標準[M].北京：首都師范大學(xué)出版社，1998：211.

[4]福建省食品藥品監(jiān)督管理局.福建省中藥材標準[M].福州：海風出版社,2006:211.

[5]中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第一冊)[M].北京：科學(xué)出版社，1972：116.