魯波

·論著·

翼狀胬肉手術(shù)治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化分析

魯波

目的探討翼狀胬肉手術(shù)治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化，分析相關(guān)生物學(xué)因子在翼狀胬肉中的表達(dá)機(jī)制。方法52例經(jīng)過手術(shù)切除翼狀胬肉組織作為觀察組，取同期手術(shù)正常結(jié)膜組織52例作為對(duì)照組，2組都進(jìn)行iNOS、TGF-β1與CD105免疫組化分析，同時(shí)進(jìn)行淚膜破裂時(shí)間與淚液分泌試驗(yàn)。結(jié)果對(duì)照組的BUT值與Schirmer值與觀察組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在免疫組化分析中，對(duì)照組結(jié)膜組織層次清晰。觀察組結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量增加，排列不規(guī)則，成纖維細(xì)胞增生。同時(shí)觀察組的iNOS、TGF-β1與CD105表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論iNOS、TGF-β1與CD105在翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展中可能通過促進(jìn)新生血管的形成從而提高其陽性率，選擇性抑制上述因子可有效治療翼狀胬肉與減少?gòu)?fù)發(fā)。

翼狀胬肉；iNOS；TGF-β1；CD105

翼狀胬肉是眼科的常見多發(fā)病，多發(fā)生于中老年人，發(fā)病率在1/3左右[1]。調(diào)查顯示，翼狀胬肉是一種和過度紫外線照射有關(guān)的侵入性、炎癥性和增生性眼表疾病，同時(shí)具有某些腫瘤樣特性，但當(dāng)前關(guān)于翼狀胬肉的病因及發(fā)病機(jī)制尚未形成公認(rèn)的理論[2]。手術(shù)是目前治療翼狀胬肉的主要手段，但是術(shù)后高復(fù)發(fā)率一直困擾著國(guó)內(nèi)外眼科學(xué)工作者，局部使用絲裂霉素、自體結(jié)膜移植、β射線照射、聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植等可以減少胬肉的復(fù)發(fā)[3，4]。近年來，隨著與眼科相關(guān)的分子生物學(xué)研究的深入，研究相關(guān)生物學(xué)特性的因子的變化可防治翼狀胬肉復(fù)發(fā)提供相關(guān)依據(jù)。NO是近年來發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)信使分子，iNOS其可以抑制DNA修復(fù)酶的活性，提高腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[5]。TGF-β1與CD105也都具有多種生物功能，人們發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中TGF-β1與CD105表達(dá)增高[6]。翼狀胬肉細(xì)胞的異常增殖以及術(shù)后復(fù)發(fā)的特性與腫瘤的生物學(xué)行為相似，為此iNOS、TGF-β1與CD105應(yīng)該在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用[7，8]。本文探討翼狀胬肉手術(shù)治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化，分析相關(guān)生物學(xué)因子在翼狀胬肉中的表達(dá)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院眼科門診2010年8月至2013年2月收治的52例經(jīng)過手術(shù)切除翼狀胬肉組織作為觀察組，其中男22例，女30例；年齡31～80歲，平均年齡(56.33±0.25)歲；病程1～30年，平均(4.56±0.11)年。取同期手術(shù)正常結(jié)膜組織52例作為對(duì)照組，男20例，女32例；年齡35～80歲，平均年齡(56.25±0.36)歲。2組取材前均經(jīng)患者知情同意，所有病例均無其他角膜、結(jié)膜疾病。2組患者性別比、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 儀器與免疫組化試劑 實(shí)驗(yàn)儀器主要包括切片機(jī)(Shandon AS325 德國(guó)萊卡公司)、生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(TB-718D2 湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)、全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)(ZT-12J 英國(guó)Shandon 公司)等。主要試劑包括SP免疫組化試劑盒(DAK 公司)、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(Invitrogen 公司)、兔抗人iNOS 多克隆抗體(NeoMarkers 公司)、鼠抗人CD105單克隆抗體(河北博海生物工程開發(fā)有限公司)。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。然后采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟，乙醇梯度水化，室溫孵，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水中沖洗，抗原修復(fù)；室溫放置，PBS泡洗，滴加一抗，PBS泡洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的二抗，37℃孵育；PBS漂洗， DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min。

1.3 結(jié)果判定 所有切片均經(jīng)病理科副主任醫(yī)師協(xié)助觀察，在高倍顯微鏡下(×200)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，iNOS、TGF-β1與CD105表達(dá)結(jié)果分別記錄為陰性(-)：無陽性細(xì)胞；弱陽性(+)：陽性細(xì)胞率小于50%；強(qiáng)陽性(++)：切片中陽性細(xì)胞率大于50%。弱陽性、中度陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)都為陽性表達(dá)。2組同時(shí)進(jìn)行淚膜破裂時(shí)間(BUT)實(shí)驗(yàn)測(cè)定與淚液分泌實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 淚膜破裂時(shí)間與淚液分泌試驗(yàn)結(jié)果比較 2組淚膜破裂時(shí)間與淚液分泌試驗(yàn)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組淚膜破裂時(shí)間與淚液分泌試驗(yàn)結(jié)果比較

表1 2組淚膜破裂時(shí)間與淚液分泌試驗(yàn)結(jié)果比較

組別淚液分泌試驗(yàn)(mm/5min)淚膜破裂時(shí)間(s)觀察組9.97±0.349.65±0.26對(duì)照組10.40±0.1610.86±0.83t值12.63513.698P值<0.05<0.05

2.2 iNOS表達(dá)情況 iNOS主要陽性部位為翼狀胬肉組織細(xì)胞的細(xì)胞膜。對(duì)照組結(jié)膜組織層次清晰。觀察組結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量增加，排列不規(guī)則，成纖維細(xì)胞增生。觀察組的iNOS表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1、2，表2。

圖1 正常結(jié)膜組織iNOS(HE×200)

圖2 翼狀胬肉組織iNOS(HE×200)

2.3 TGF-β1表達(dá)情況 TGF-β1主要陽性部位為翼狀胬肉組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，包括成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，同時(shí)觀察組的TGF-β1表達(dá)陽性率明顯也高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖3、4，表2。

圖3 正常結(jié)膜組織TGF-β1(HE×200)

圖4 翼狀胬肉組織TGF-β1(HE×200)

2.4 CD105表達(dá)情況 CD105主要在翼狀胬肉組織的上皮細(xì)胞、新生血管的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，同時(shí)觀察組的CD105表達(dá)陽性率明顯也高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖5、6，表2。

3 討論

翼狀胬肉是一種臨床上比較常見且多發(fā)的慢性眼表疾病。目前普遍認(rèn)為翼狀胬肉是多因素共同作用的結(jié)果，比如在紫外線照射下，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，身體正常的免疫反應(yīng)激活肥大細(xì)胞并釋放出大量細(xì)胞因子，參與新生血管形成[9]；肥大細(xì)胞釋放大量活性物質(zhì)及轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞表達(dá)異常蛋白影響改變了其生存的微環(huán)境，導(dǎo)致角膜散光、眼球轉(zhuǎn)動(dòng)受限和眼部刺激癥狀，給患者造成巨大的痛苦。研究表明淚膜功能異常是導(dǎo)致干眼癥、角膜、結(jié)膜病變等多種眼表疾病的重要原因[10，11]。本文對(duì)照組的淚膜破裂時(shí)間和淚液分泌試驗(yàn)值與觀察組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明淚膜的正常與穩(wěn)定是維持眼表上皮正常結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，各種原因引起淚膜不穩(wěn)定是翼狀胬肉發(fā)生的重要原因。

圖5 正常結(jié)膜組織CD105(HE×200)

圖6 翼狀胬肉組織CD105(HE×200)

表2 iNOS、TGF-β1與CD105表達(dá)陽性率比較 n=52，例(%)

由于在翼狀胬肉中發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)，且翼狀胬肉雖不是腫瘤，但卻具有與腫瘤類似的特點(diǎn)。NO對(duì)于凋亡的調(diào)節(jié)具有兩面性、細(xì)胞類型特異性和濃度依賴性的特點(diǎn)。在正常生理?xiàng)l件下，各組織細(xì)胞的iNOS活性幾乎不表達(dá)，病理狀態(tài)下主要受一些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)而激活。TGF-β1是一類對(duì)靶細(xì)胞具有多種特殊作用的多肽，通常狀態(tài)下TGF-β1就以這種無活性或潛在活性形式分泌，在特定條件下，無活性的TGF-β1就轉(zhuǎn)變?yōu)榱擞谢钚缘腡TGF-β1，后者與相應(yīng)受體結(jié)合，發(fā)揮其生理功能[12]。一般來說，TGF-β1表達(dá)在翼狀胬肉組織中有顯著增加，尤以復(fù)發(fā)性翼狀胬肉組織中為甚。CD105是一類新的細(xì)胞粘附分子，是一種與增生有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜抗原，在與腫瘤有關(guān)的新生血管內(nèi)皮強(qiáng)烈表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中，CD105標(biāo)識(shí)的微血管密度值優(yōu)于CD34等標(biāo)記的微血管密度值[13]。本文結(jié)果顯示，對(duì)照組結(jié)膜組織層次清晰。觀察組結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量增加，排列不規(guī)則，成纖維細(xì)胞增生。同時(shí)觀察組的iNOS、TGF-β1與CD105表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

綜上所述，iNOS、TGF-β1與CD105在翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展中可能通過促進(jìn)新生血管的形成從而提高其陽性率，選擇性抑制上述因子可成為手術(shù)治療翼狀胬肉與減少?gòu)?fù)發(fā)的新思路。

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