于海玲,王發(fā)國,李仕裕

(1.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650；2.中國科學院大學，北京 100049)

東方百合離體再生前后葉片遺傳穩(wěn)定性的ISSR檢測

于海玲1,2,王發(fā)國1,李仕裕1,2

(1.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650；2.中國科學院大學，北京 100049)

以東方百合品種西伯利亞(Siberia)為材料，對影響百合ISSR-PCR的主要參數(shù)進行優(yōu)化，確立了所適用的ISSR反應體系和擴增條件，并采用Mix體系進行引物篩選，得出最佳引物為：3A30、3A37、UBC815和UBC844。利用本試驗優(yōu)化的引物和Mix體系，對組織培養(yǎng)再生前后的百合葉片遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性進行檢測，結果表明，再生前后百合葉片遺傳物質(zhì)未發(fā)生明顯變化，穩(wěn)定性較高。因此，可以采用組培快繁的方法擴大東方百合原種的生產(chǎn)量。

東方百合;ISSR;葉片再生;遺傳穩(wěn)定性

百合(LiliumSpp)，又名強仇、百合蒜、摩羅、中庭等，隸屬單子葉植物亞綱百合科，為多年生草本球根花卉。百合花朵大，花色豐富多彩，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能應用在園林綠地中，是著名的觀賞花卉。百合還可食用、藥用等，因此在國內(nèi)外花卉市場上占有重要的地位。東方百合是百合中最具有市場優(yōu)勢的切花品種，包括天香百合、鹿子百合、日本百合衍生的品種以及它們與湖北百合的雜交種。東方百合開放的花朵為碗形花，是百合中花朵最大的。東方百合花色豐富，具有濃郁的芳香氣味，有很高的觀賞價值。近年來，東方百合雜交種的栽培面積越來越大，在切花生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[1]。

簡單重復序列區(qū)間擴增標記(inter simple sequence repeat,ISSR)是在簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)基礎上創(chuàng)建、基于PCR擴增的一種新型分子標記技術。ISSR分子標記通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有技術簡便快捷、穩(wěn)定性強、DNA多態(tài)性高等優(yōu)點。ISSR不像SSR具有物種特異性，其產(chǎn)物多態(tài)性比RAPD、RFLP等分子標記更加豐富，可提供更多基因組信息，且穩(wěn)定可靠，試驗重復性更好。目前已在遺傳作圖、遺傳多樣性、分子標記育種、種質(zhì)鑒定、基因定位等方面得到廣泛應用[2]。

不論對無性繁殖試管苗，還是以轉(zhuǎn)基因研究為目標的植株再生體系，都要求既簡單、快速、高效，又必須保持原有品種的優(yōu)良特性。再生植株在遺傳上的穩(wěn)定性是組培快繁和轉(zhuǎn)基因研究能否成功的關鍵因素。百合再生體系研究大多通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來保證大部分外植體的分化率[3-6]，但對再生植株是否發(fā)生了DNA水平的變異尚少見報道。本研究采用ISSR分子標記法對葉片再生前后的百合進行遺傳穩(wěn)定性鑒定，以期采用組培快繁的方法來擴大東方百合原種的生產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

50株第3代葉片組織培養(yǎng)再生后的東方百合品種西伯利亞(Siberia)葉片和母株葉片(對照)，由西北農(nóng)林科技大學超低溫實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 分別采用改良的CTAB法[7]和DNA試劑盒(北京天根公司)提取50個再生后植株葉片及母株葉片DNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠(瓊脂糖0.45 g溶解于30 mL 1×TBE中)電泳檢測DNA質(zhì)量。在紫外分光光度計下測其濃度，最后稀釋標定值10 ng·μL-1，放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 體系篩選 為確定東方百合ISSR-PCR的最適擴增條件，在預試驗的基礎上，采用單因素試驗設計，以UBC845和3A8為引物，對影響PCR的主要因子：Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度等進行梯度試驗；在單因素變量試驗的基礎上，每個因素選擇3個適宜水平進行組合試驗，以確定東方百合ISSR-PCR的最佳反應組合體系。

1.2.3 引物篩選 引物篩選采用以下2種方法。(1)根據(jù)上述試驗設計，選擇出較優(yōu)的體系。采用該體系中的設計參數(shù)，進行引物的篩選。即在Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP濃度、引物濃度一定的基礎上，改變引物的種類，通過PCR擴增、電泳、紫外凝膠成像，根據(jù)結果來選擇適合東方百合ISSR反應的最佳引物。(2)采用沃爾森技術有限公司Mix反應體系直接進行引物的篩選。Mix反應體系適合絕大多數(shù)的ISSR反應，與方法(1)相比，不用進行體系篩選，因而較為簡單、易操作。本試驗采用第2種方法篩選出引物，未采用篩選出的較優(yōu)體系進行引物篩選。

隨機選取DNA模板在25 μL反應體系中進行擴增篩選，從24個ISSR引物(沃爾森公司的3A系列引物和UBC系列引物)中選取12個擴增條帶清晰、重復性好的引物(表1)用于進一步的PCR擴增。本試驗采用的25 μL反應體系中含1 μL引物、1 μL DNA、12.5 μL Taq Mix、10.5 μL ddH2O，其中，引物為10 mmol·μL-1。

表1 ISSR引物對東方百合再生植株的擴增1)Table 1 ISSR analysis of oriental lily renewable plants with 12 primers

1)*為篩選出的最佳引物;R=(A,G)，Y=(C,T)。

1.2.4 PCR擴增程序 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，52.8 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，40個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測 取5 μL擴增后的產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(瓊脂糖0.45 g溶解于30 mL 0.5×TBE中)、120 V電壓下，電泳30 min，用溴化乙錠染色10 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察、記錄、保存圖像。

2 結果與分析

2.1 DAN提取結果

本試驗中2種提取方法對比表明，DNA試劑盒提取的DNA在1.5%瓊脂糖膠電泳上呈現(xiàn)為清晰的條帶，RNA去除干凈，無降解現(xiàn)象或降解很少，無拖尾，無彌散，且質(zhì)量比較穩(wěn)定，一致性高，質(zhì)量與濃度均比CTAB方法提取的DNA高。故在后續(xù)的體系篩選、引物篩選等試驗中均采用DNA試劑盒所提取的基因組DNA(圖1)。

圖1 東方百合部分樣品的DNA電泳圖譜(DNA試劑盒提取)Fig.1 The electrophoretogram of some samples of lilium by plant genomic DNA Kit

2.2 體系篩選

從瓊脂糖凝膠電泳檢測結果來看，在20 μL反應體系中，體系14、23、26、27、14′、16′、17′、22′譜帶較為清晰，多態(tài)性較高，其他體系未擴增出清晰的條帶或者表現(xiàn)出極低的多態(tài)性(圖2)。其中27、22′和17′體系較優(yōu)。①27：Buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、Mg2+2.0 μL、3A8引物1.5 μL、DNA 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.7 μL；②22′：Buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、Mg2+1.5 μL、UBC845引物1.0 μL、DNA 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 16.7 μL；③17′：Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、Mg2+2.0 μL、3A8引物1.2 μL、DNA 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 16.5 μL。其中，1×Buffer，Taq酶5 U·μL-1，引物10 mmol·μL-1，Mg2+25 mmol·μL-1，dNTP 2.5 mmol·L-1。

2.3 引物篩選

采用前述Mix反應體系，對24條引物進行PCR后的結果如圖3所示。從圖3可見，編號為2、4、6、7、8、12、14、18、19、22的引物，擴增的條帶較多，且相對清晰。由于條帶不很清晰，拖尾現(xiàn)象較為明顯，故對所挑選出的引物再次進行PCR擴增(圖4)。

經(jīng)過篩選，確定了4個最佳引物，分別為:3A30、3A37、UBC815和UBC844(表1)。

2.4 PCR擴增結果

利用24個ISSR隨機引物對東方百合再生植株葉片基因組進行PCR擴增，大部分引物均能擴增出DNA條帶，擴增條帶數(shù)和長度各不相同。經(jīng)反復試驗，其中擴增穩(wěn)定且條帶清晰的引物有12個(圖3、4)。該12個引物共擴增出63條清晰的譜帶，各引物擴增出的譜帶數(shù)為3-10條，平均每個引物擴增5.2條(表1)。從條帶數(shù)目以及清晰無拖尾現(xiàn)象來看，雖然引物3A8擴增出的條帶較多，但幾次試驗穩(wěn)定性不高，且條帶不清晰，因此以引物3A30、3A37、UBC815、UBC844擴增效果最好，為篩選出的最佳引物(圖4)，用于后續(xù)試驗。依片段大小，DAN長度均在250-2000 bp之間，其中63條帶全部為單態(tài)帶，多態(tài)位點百分率為0(圖5)。

1-27體系所用引物為3A8;1′-27′體系所用引物為UBC845。

圖3 不同引物ISSR-PCR擴增反應結果Fig.3 The result of ISSR-PCR by different primers

M為Marker DL2000。

M為Marker DL2000；0為母本植株葉片；其余均為再生后的百合葉片。

2.5 遺傳穩(wěn)定性檢驗

對百合母株葉片和50株再生后葉片分別完成DNA提取后，采用前述Mix體系和已篩選出的4條引物，隨機選取7株再生后葉片的DNA進行PCR擴增，擴增結果如圖5所示。

從瓊脂糖凝膠電泳檢測結果來看，相同引物擴增出的條帶較為一致，說明百合經(jīng)離體再生培養(yǎng)后的再生植株在DNA水平上基本沒有變化，未顯示出與母株不同的多態(tài)性(圖5)，也可見百合組織培養(yǎng)過程中未引起植物體細胞無性系的明顯變異，經(jīng)離體再生培養(yǎng)后的植株與母株的遺傳特性保持一致。

3 小結

東方百合具有極高的經(jīng)濟價值和觀賞價值，市場需求量也逐漸增大。目前我國東方百合原種的種球主要以進口為主，價格昂貴，常規(guī)的分球繁殖方法繁殖系數(shù)較小，遠不能滿足市場需求[8]。采用組織培養(yǎng)的方法進行東方百合種苗(球)工業(yè)化生產(chǎn)是解決這一問題的有效途徑[9]。將組織培養(yǎng)的方法用于快繁，關鍵在于保持其優(yōu)良品性，這一點對于一些具有極高觀賞價值的東方百合來說更為重要。采用ISSR分子標記對一定數(shù)量的隨機引物進行分析，可以給出覆蓋整個基因組DNA的多態(tài)性信息，并直接從DNA水平檢測堿基序列的變化，因此可以從分子水平上闡明組培苗遺傳穩(wěn)定性的分子機理[10]。本研究應用ISSR分子標記技術對東方百合組培再生苗基因組DNA進行分析，得到的DNA片段無論是帶型還是譜帶的強弱、數(shù)目均與再生前的母株DNA一致。這說明再生苗在DNA水平上并未發(fā)生變異，其遺傳物質(zhì)是穩(wěn)定的，保持了母株的遺傳特性，這與前人關于土三七[11]、小蔓長春花[12]、越橘[13]等組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究報道一致。由此可見，以組培快繁技術快速擴大東方百合原種的生產(chǎn)量是可行的。

[1]王清華.東方百合組織培養(yǎng)淺述[J].青海農(nóng)林科技,2007(3):39-51.

[2]鄭明文,吳祝華,席夢利,等.岷江百合ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化[J].林業(yè)科技開發(fā),2007,21(6):19-22.

[3]張靜,劉菊華,徐碧玉,等.東方百合高效離體再生體系的建立[J].熱帶作物學報,2011,32(2):269-272.

[4]趙慶芳,曾小英,丁蘭,等.東方百合組織培養(yǎng)和快速繁殖研究[J].西北師范大學學報:自然科學版,2003,39(1):66-68.

[5]柳玉晶,龔束芳,樊金萍,等.百合愈傷組織的誘導及植株再生[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(3):352-355.

[6]袁芳亭,陳龍清.麝香百合的葉片離體培養(yǎng)及植株再生[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2001(3):50-51.

[7]鄒喻蘋,葛頌,王曉東.系統(tǒng)與進化植物學中的分子標記[M].北京:科學出版社,2001:13-22.

[8]趙祥云,王樹棟,陳新露,等.百合[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:52-61.

[9]鄒迎春,覃大吉,魏代俊,等.東方百合組培快繁技術研究[J].湖北民族學院學報:自然科學版,2009,27(4):449-451.

[10]高麗,楊波,李洪林.葉藝春蘭組培苗遺傳穩(wěn)定性的ISSR研究[J].亞熱帶植物科學,2007,36(2):13-17.

[11]岑舉人,步懷宇,張來軍,等.土三七不定芽直接發(fā)生與遺傳穩(wěn)定性的RAPD分析[J].核農(nóng)學報,2010,24(3):502-506.

[12]何斌,侯恩太,王英娟,等.小蔓長春花組織培養(yǎng)快速繁殖中的遺傳穩(wěn)定性[J].植物生理學報,2012,48(2):197-201.

[13]李曉艷,張志東,李亞東,等.越橘組培苗遺傳穩(wěn)定性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2009,31(5):521-523.

(責任編輯:陳幼玉)

AssessmentofgeneticstabilityofleavesinvitroregeneratedfromorientallilybyISSR

YU Hai-ling1,2,WANG Fa-guo1,LI Shi-yu1,2

(1.South China Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou,Guangdong 510650,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

The optimal ISSR-PCR reaction conditions in oriental lily Siberia(Lilium×Siberia)was established according to the main parameters.The Mix system was adopted for primer screening and the best primers drawn were 3A30,3A37,UBC815,UBC844.Using the experimental optimization primers and the Mix system,the genetic stabilites of the leaves before and after regeneration were investigated.The results showed that the genetic stabilities of the leaves before and after regeneration did not change sigenificantly.The genetic stabilities were high.Therefore,tissue culture methods can be used to expand the production of original oriental lily.

oriental lily;ISSR;leaves regeneration;genetic stability

2013-12-25

于海玲(1988-)，女，碩士研究生。研究方向：園林植物應用。

S682.2+9

A

1673-0925(2014)01-0035-06