， ，，，，， ，

(1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海200080；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床外科應(yīng)用解剖學(xué)教研室，安徽 淮南232001)

結(jié)腸癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病趨勢(shì)不斷上升，上海地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率已高居全部惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，死亡率位于第三位[1]。目前，結(jié)腸癌手術(shù)治療技術(shù)成熟，術(shù)后能進(jìn)行規(guī)范性化療。但是患者5年總體生存率僅達(dá)到50%～55%，生存率并沒(méi)有明顯提高，其主要原因是缺少判斷預(yù)后和預(yù)測(cè)化療耐藥的靈敏指標(biāo)，這也是制約目前臨床診治的核心問(wèn)題[2]。因此，探尋并應(yīng)用新型預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)與化療敏感性的分子指標(biāo)是臨床亟待解決的問(wèn)題[3]。V-ATPase是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的胞質(zhì)膜及細(xì)胞管泡膜系統(tǒng)中的H+泵[4]。新發(fā)現(xiàn)V-ATPase基因在

非小細(xì)胞肺癌[5]和食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，而且與化療耐藥高度相關(guān)[5-6]，但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)V-ATPase基因在結(jié)腸癌中表達(dá)及其意義報(bào)道尚少。因此，為了提高結(jié)腸癌的術(shù)后的治愈率和生存率，本研究通過(guò)分析V-ATPase基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系，探討V-ATPase基因?qū)Y(jié)腸癌生物學(xué)的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院胃腸外科標(biāo)本庫(kù)的68例結(jié)腸癌患者腫瘤標(biāo)本及患者對(duì)應(yīng)的正常組織樣本。其中男29例，女39例，患者平均年齡64.22歲。全部為結(jié)腸腺癌,其中升結(jié)腸癌23例，橫結(jié)腸癌8例，降結(jié)腸癌37例。按美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)對(duì)結(jié)腸癌分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期者9例。病理檢查顯示高分化者40例，中等分化者26例，低分化者2例。發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者8例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者14例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者54例。術(shù)中發(fā)現(xiàn)脈管浸潤(rùn)者13例，其余55例無(wú)脈管浸潤(rùn)。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及熒光定量聚合酶鏈反(qPCR)檢測(cè) 隨機(jī)選取20對(duì)新鮮冰凍組織，應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))提取總RNA，然后采用cDNA合成試劑盒(Thermo公司，美國(guó))根據(jù)使用說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后使用熒光定量檢測(cè)試劑盒(Thermo公司，美國(guó))，在Eppendoff公司生產(chǎn)的PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)中使用的引物序列為：①V-ATPase上游引物序列5’-ATGGCCATGGAGATAGACAGC-3’；②V-ATPase下游引物序列5’-CCATGGCTGCAAAGACGATG-3’；③GAPDH上游引物序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’；④GAPDH下游引物序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。QPCR反應(yīng)條件為：起始變性95 ℃時(shí)間10 min，45個(gè)循環(huán)(變性95 ℃時(shí)間10 s、退火60 ℃時(shí)間30 s、延伸72 ℃時(shí)間30 s)。每種實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。V-ATPase變化的2-ΔΔCt用于表示V-ATPase基因的表達(dá)量，V-ATPase在結(jié)腸腫瘤組織相對(duì)配對(duì)正常組織中的表達(dá)計(jì)算公示為：V-ATPase△Ct=(Avg．V-ATPase_Ct-Avg．GAPDH_Ct);V-ATPase△△Ct=(V-ATPase△Ct_tumor-V-ATPase△Ct_non-tumor)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) 從標(biāo)本庫(kù)中提取本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取的68對(duì)組織樣本制作的石蠟切塊，并制備厚度為4 μm的切片。然后采用兩步法進(jìn)行免疫組化染色實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)脫蠟、尿素消化、3%H2O2封閉和微波修復(fù)等步驟后，一抗孵育并4 ℃過(guò)夜；次日復(fù)溫后，抗兔二抗( EnVision)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次沖洗10 min，顯微鏡下加DAB(1∶40)顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇化、脫水和中性樹(shù)膠封片，并在室溫風(fēng)干后光鏡下觀察。根據(jù)V-ATPase染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，分為：3分(強(qiáng)陽(yáng)性)、2分(中等陽(yáng)性)、1分(弱陽(yáng)性)、0分(陰性)；根據(jù)V-ATPase染色陽(yáng)性面積評(píng)分，分為3分(51～100%)、2分(10～50%)、1分(小于10%)、0分(0)。按照我們前期病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，V-ATPase免疫組化染色總評(píng)分為V-ATPase染色免疫染色強(qiáng)度與染色面積評(píng)分和[7]：(5～6)分，強(qiáng)陽(yáng)性；(3～4)分，弱陽(yáng)性；(0～2)分，陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher’S確切概率法檢驗(yàn)。所有比較均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 V-ATPase基因在結(jié)腸癌組織及配對(duì)正常組織中 的表達(dá)

20對(duì)新鮮冰凍組織中V-ATPase mRNA的平均相對(duì)表達(dá)量分別為(5.37±0.44)和(2.03±0.35)，對(duì)特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果驗(yàn)證了此結(jié)果，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。免疫組化染色顯示，68例患者腫瘤組織中V-ATPase基因陽(yáng)性表達(dá)者47例(69.1%)，而配對(duì)正常腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)者僅有4例(5.8%)，兩組間差異顯著，而且V-ATPase陽(yáng)性表達(dá)主要出現(xiàn)在腫瘤組織的胞膜和胞質(zhì)中。

2.2 V-ATPase基因表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

V-ATPase基因的高度表達(dá)與結(jié)腸癌患者的T分期(P<0.001)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.044)、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.049)、AJCC分期(P=0.012)、脈管浸潤(rùn)(P=0.044)以及腫瘤分化程度(P<0.001)有關(guān)；但對(duì)結(jié)腸癌患者的年齡(P=0.342)、性別(P=0.981)和腫瘤發(fā)生部位(P=0.393)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅰ～Ⅱ期患者中，V-ATPase陽(yáng)性表達(dá)者為50%(12/24)，Ⅲ～Ⅳ期患者中陽(yáng)性表率高達(dá)79.5%(35/44)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示V-ATPase基因在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，進(jìn)一步證明qPCR檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1、圖2。這些結(jié)果同樣提示了V-ATPase基因可能參與了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。

表1 V-ATPase表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

T：腫瘤組織；N：配對(duì)正常黏膜組織

a:正常黏膜組織(陰性)；b:腫瘤組織(陰性)；c:腫瘤組織(弱陽(yáng)性)；d:腫瘤組織(強(qiáng)陽(yáng)性)

圖2V-ATPase在結(jié)腸癌組織中免疫組化EnVinsion法染色(×200)

3 討論

V-ATPase廣泛存在真核生物胞質(zhì)膜及細(xì)胞管泡膜系統(tǒng)中，編碼一種能主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)H+的蛋白。正常情況下V-ATPase蛋白由跨膜的V0亞基和胞質(zhì)內(nèi)的V1亞基組成，兩種亞基聚合時(shí)，能利用分解ATP產(chǎn)生的能量逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)H+，從而維持細(xì)胞內(nèi)外在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的pH值[4]。在腫瘤細(xì)胞中V-ATPase常常過(guò)表達(dá)，這樣不但能抑制細(xì)胞內(nèi)酸化對(duì)抗細(xì)胞凋亡，而且胞外高濃度H+可以改變蛋白水解酶的活性，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的分解，進(jìn)而影響了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[8]。

本文研究結(jié)果顯示，69.1%結(jié)腸癌組織中V-ATPase顯示高表達(dá)，而配對(duì)的正常組織中僅有5.8%的陽(yáng)性表達(dá)率。不論是在mRNA水平還是在蛋白水平，V-ATPase在結(jié)腸癌組織中表達(dá)均顯著高于配對(duì)正常組織，說(shuō)明V-ATPase過(guò)表達(dá)同時(shí)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平。通過(guò)分析V-ATPase表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步揭示了V-ATPase與結(jié)腸癌臨床分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)及腫瘤組織的分化程度顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別和腫瘤發(fā)生部位則無(wú)明顯相關(guān)性。從而提示結(jié)腸癌中V-ATPase過(guò)表達(dá)很有可能參與了腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。另外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的提高，結(jié)腸癌中V-ATPase的陽(yáng)性表達(dá)率也也明顯升高(Ⅰ～Ⅱ期為50%；Ⅲ～Ⅳ期為79.5%)，這表明結(jié)腸癌分期越晚，V-ATPase的陽(yáng)性表達(dá)率越高，也說(shuō)明V-ATPase的過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)展呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，V-ATPase的過(guò)表達(dá)后能促進(jìn)MMP(matrix metalloproteinases)分泌，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，而抑制V-ATPase后，腫瘤細(xì)胞的侵襲力大大減弱[8-9]。近來(lái)，也有許多研究表明，V-ATPase參與了黑色素瘤、乳腺癌和肝癌的侵襲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9-12]，并且與非小細(xì)胞肺癌和食管鱗癌的浸潤(rùn)以及化療耐藥有關(guān)[5-6]。從而提示V-ATPase在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用，可能成為結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后判斷的重要分子標(biāo)記物和化療預(yù)測(cè)的靈敏指標(biāo)。

V-ATPase過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥關(guān)系密切，我們也發(fā)現(xiàn)V-ATPase過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為有顯著影響，但目前V-ATPase對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及結(jié)腸癌化療耐藥影響的具體機(jī)制仍不明確。因此，我們需要進(jìn)一步探討V-ATPase對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展生物學(xué)的作用，尋找新的結(jié)腸癌診療靶點(diǎn)，全面提高結(jié)腸癌患者的診治效果。

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