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(1.內蒙古包鋼第三職工醫(yī)院外二科，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古包頭醫(yī)學院人體解剖學教研室，內蒙古 包頭 014060)

坐骨神經(jīng)損傷臨床比較多見，發(fā)病率高、癥狀明顯、危害較大[1]。因此，坐骨神經(jīng)損傷后如何能有效促進損傷神經(jīng)功能再生，提高修復治療效果，一直是臨床和基礎的關注焦點，也是一個迄今沒有完全解決的難題。中藥治療有著整體和局部雙重兼顧的優(yōu)勢，其過程也符合神經(jīng)損傷修復的綜合過程[2]，是非常具有發(fā)展前景的治療方式。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)能促進多種運動神經(jīng)元的存活，具有多種生物活性[3]，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和神經(jīng)損傷修復過程中具有重要意義[4]。雛菊葉龍膽(Bellidifolin)為龍膽科1年生植物，全草入蒙藥，蒙古族醫(yī)學上作為“桑地格”使用，有清熱解毒的功效。近些年發(fā)現(xiàn)，該藥對腦出血、腦血栓等腦血管疾病也有很好的療效[5-6]。盡管許多研究都報道其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復有一定的促進作用，但對周圍神經(jīng)功能恢復方面的研究尚處于起步階段，國內外的報道并不多見。因此，我們以大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型來進行觀察，探討雛菊葉龍膽是否對神經(jīng)損傷有促進功能修復的作用，并探討其作用機制中是否有局部釋放睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的機制參與。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

取2月齡清潔成年雄性Wistar大鼠，體質量250～300 g，共225只。動物及飼料均購于內蒙古大學動物實驗中心(SCXK(蒙)2002-0001)，實施手術前先進行適應性飼養(yǎng)3～5 d。雛菊葉龍膽由包頭醫(yī)學院藥學院提供，用生理鹽水配成25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg不同濃度的藥液，置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩＜租挵菲徲诒本┬菂轻t(yī)藥有限公司，每片0.5 mg，用生理鹽水配制成100 μg/kg的溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)損傷模型的制備 10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，仰臥固定、脫毛、消毒，無菌條件下右下肢股后縱切口約1.5 cm，分離骨骼肌，充分顯露并游離坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣0.8 cm處離斷，縫合神經(jīng)外膜并做標記，逐層關閉切口。所有操作均由1人完成。術后觀察動物清醒后，分籠飼養(yǎng)，勤換墊料以防止足底潰瘍發(fā)生。

1.2.2 實驗動物分組 將造模成功的大鼠以每組45只隨機數(shù)字表法分為5組。實驗組以25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg的劑量分別腹腔注射雛菊葉龍膽，連續(xù)5周，每天1次。甲鈷胺組注射100 mg/kg甲鈷胺，該藥廣泛應用于周圍神經(jīng)病的臨床治療；對照組給予同樣劑量生理鹽水。各組又都以右側為損傷側，左側為健康對照進行對比。

1.2.3 檢驗指標及方法 于第1周、3周、5周時重新麻醉動物，將原來的切口切開，暴露出坐骨神經(jīng)吻合口處。采用BL-420 F電生理儀檢測記錄神經(jīng)平均傳導速度(motor nerve conduction velocities,MNCV)。取手術側腓腸肌，用4%多聚甲醛溶液進行固定，脫水、石蠟包埋、切片及HE染色。利用Imagin-J圖像軟件放大1 000倍下進行測量計算肌細胞截面積，求其平均值。術后3周時，取切口吻合處遠端坐骨神經(jīng)組織5 mm，正常側也取相應節(jié)段的神經(jīng)組織，用4%多聚甲醛PBS液進行固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片及烤片，按照購買的免疫組化試劑盒說明方法，對切片的CNTF蛋白進行檢測，攝取圖像。每組隨機取15張切片，顯微鏡下圖像分析軟件測定陽性細胞面積與總面積比值，分析計算每組細胞的陽性比率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2 結果

2.1 各組神經(jīng)傳導速度測定值

第1、3、5周檢測記錄神經(jīng)平均傳導速度結果見表1。各組大鼠的坐骨神經(jīng)平均傳導速度檢測中，生理鹽水組在1、3、5各周都較低，而甲鈷胺組傳導速度值較高，與生理鹽水組、雛菊葉龍膽25 mg組相比，差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P=0.019)。但在各時間點雛菊葉龍膽25 mg組與生理鹽水組相比，差異不明顯，還不能說明這二者之間有統(tǒng)計學差異(P=0.17)。而雛菊葉龍膽50 mg組與75 mg組相比，差異也沒有明顯統(tǒng)計學意義。而這2組與甲鈷胺組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。

表1 各時間段坐骨神經(jīng)平均傳導速度

*：與生理鹽水組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.01;#：與生理鹽水組、甲鈷胺組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.05

2.2 腓腸肌肌細胞截面積測量結果

利用Imagin-J圖像分析系統(tǒng)對各組大鼠不同時間的腓腸肌HE染色切片(圖1)中肌細胞截面積進行測定，結果見表2。術后3周可見甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組與75 mg組細胞截面積較大。細胞排列整齊，緊密。生理鹽水組可見細胞排列紊亂，細胞間隙增加。其中甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組與其他組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.016)，而這3組之間無顯著性差異。

表2 各組不同時間腓腸肌細胞截面積

*：與其他組比較，P<0.05

2.3 免疫組化檢測CNTF結果

各組分別于第3周行免疫組織化學方法檢測坐骨神經(jīng)中CNTF，檢測結果中陽性細胞占細胞總面積的比例結果見圖2。由圖中可見生理鹽水組與雛菊葉龍膽25 mg組比較，2者之間沒有顯著統(tǒng)計學差異，這2組與甲鈷胺組、雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)，而在甲鈷胺組與雛菊葉龍膽50 mg組、75 mg組之間相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.065)。

3 討論

平均傳導速度作為電生理的一項指標，其值大小與纖維直徑、髓鞘厚度及成熟程度有關[7]。神經(jīng)膠質細胞包繞軸突形成髓鞘和神經(jīng)膜，在神經(jīng)纖維的再生修復中起誘導營養(yǎng)及促進軸突生長和成熟的作用[8]。坐骨神經(jīng)損傷后，肌細胞直徑及其截面積隨失神經(jīng)支配時間的延長呈進行性下降，是肌肉萎縮的可靠形態(tài)學指標。本實驗中雛菊葉龍膽各劑量組與甲鈷胺組相比，甲鈷胺對改善坐骨神經(jīng)離斷縫合術后功能恢復方面作用相對要優(yōu)于雛菊葉龍膽25 mg組，可能因為臨床應用雛菊葉龍膽也是組入方劑，單獨用藥效果不如聯(lián)合其他中、蒙藥使用效果好。提示本實驗室進一步的研究可以在蒙藥的組合作用方面進行深入研究。

a：生理鹽水對照組；b：甲鈷胺組；c：雛菊葉龍膽25 mg組；d：雛菊葉龍膽50 mg組；e：雛菊葉龍膽75 mg組

*:與生理鹽水組和雛菊葉龍膽25 mg組比較，P<0.05

雛菊葉龍膽25 mg組的效果與其他2組相比，在提高實驗動物神經(jīng)傳導速度和腓腸肌肌細胞截面積方面，效果相對差一些，結果有明顯統(tǒng)計學差異?？紤]該藥物的作用也有一定的濃度范圍[9-11]，低于此濃度則藥物不能發(fā)揮作用，與注射生理鹽水的作用無顯著統(tǒng)計學差異。50 mg與75 mg劑量組相比，更大劑量可見效果與50 mg組作用相當，還不能說明劑量增加后作用更強，2者相比沒有明顯統(tǒng)計學差異?？赡苁且驗樗幬锉旧磉x擇的濃度范圍比較大，進一步可適當用不同劑量細分，深入探索藥物的量效關系，為臨床有效用藥積累實驗資料。通過本實驗的研究發(fā)現(xiàn)，雛菊葉龍膽50 mg、75 mg組在促進神經(jīng)功能恢復的過程中，神經(jīng)遠端的CNTF含量增高，提示在雛菊葉龍膽促進神經(jīng)生長的過程中有CNTF局部釋放增加的過程，為進一步研究其作用機理奠定了基礎。

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