王建敏 李 偉 劉 江

(河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011)

實驗研究

西紅花酸改善大鼠酒精性脂肪肝作用機制研究

王建敏 李 偉 劉 江

(河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011)

目的研究西紅花酸對酒精性脂肪肝大鼠的作用及其機制。方法將30只雄性SD大鼠隨機分為健康對照組、模型組及西紅花酸組，每組各10只。模型組及西紅花組大鼠均行酒精性脂肪肝造模，同時西紅花酸組予西紅花酸50mg/(kg·d)灌胃預(yù)防性治療。比較3組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)水平及肝臟極低密度脂蛋白(VLDL)分泌速率，肝臟TG、游離脂肪酸(FFA)含量，肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率及脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率，苯胺羥化酶(ANH)、乙醇脫氫酶(ADH)及乙醛脫氫酶(ALDH)活性，肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果模型組與西紅花酸組大鼠血清ALT和TG含量、肝臟TG和FFA含量、肝質(zhì)量系數(shù)均高于健康對照組(P<0．01，P<0．05)，而西紅花酸組均低于模型組(P<0．01，P<0．05)；模型組及西紅花酸組大鼠肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率、過氧化物酶體β-氧化速率和VLDL分泌速率均低于健康對照組(P<0.05，P<0.01)，且西紅花酸組脂肪酸線粒體β-氧化速率高于模型組(P<0.05)；與健康對照組比較，模型組ANH活性及MDA含量升高(P<0.05)，ADH、ALDH、SOD活性及GSH含量降低(P<0.01)，而西紅花酸組ANH活性及MDA含量較模型組降低(P<0.05)，ADH、ALDH、SOD活性及GSH含量升高(P<0.05)。結(jié)論西紅花酸對酒精性脂肪肝有改善作用，其作用機制可能是通過加速肝臟線粒體脂肪酸氧化，增強血漿中TG消除速度，減輕肝臟脂肪堆積，增強ALDH活性，進(jìn)而加速乙醇和乙醛的清除。

脂肪肝，酒精性；西紅花；疾病模型，動物；動物，實驗

由于人們社交、生活環(huán)境的改變，酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFI)的發(fā)病率也逐年升高，導(dǎo)致酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率也升高。近幾年，對AFI的研究越來越多，其發(fā)病機制主要是乙醇使肝內(nèi)脂肪代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，最終形成脂肪肝[1]。還有研究表明，大量乙醇可使體內(nèi)游離脂肪酸(FFA)增加，而FFA可損害生物膜，增加腫瘤壞死因子(TNF)的毒性作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性[2]。

西紅花酸(crocetin)是番紅花屬植物西紅花中的提取物，是一種特殊的水溶性類胡蘿卜素。有研究報道，西紅花酸可抑制細(xì)胞氧化，增強細(xì)胞抗氧化作用，主要活性部位在肝臟和腎臟，且可用于治療動脈粥樣硬化、心肌缺血、腦缺血等多種疾病，對心血管系統(tǒng)具有廣泛的活性，可改善能量代謝[3-5]。本研究通過對SD大鼠進(jìn)行酒精性脂肪肝造模，同時預(yù)防性給予西紅花酸治療，探討西紅花酸改善AFL的作用機制，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠30只，由中國藥科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號SYXK(蘇) 2013-0010，體質(zhì)量250～300g，置室溫(22±3) ℃，明暗各12h(8：00-20：00)飼養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 實驗藥品 西紅花酸：根據(jù)文獻(xiàn)[6]中Wittig Homer反應(yīng)方法生成西紅花酸二甲酯，西紅花酸二甲酯水解得西紅花酸，高效液相色譜法(HPLC法)測定含量>80%西紅花酸，用0.9%氯化鈉注射液配制成混懸液。氧化型輔酶Ⅱ(NAD，廣州市齊云生物科研試劑有限公司)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH，廣州市齊云生物科研試劑有限公司)，輔酶A(COA，上海金穗生物科技有限公司)，軟脂酰輔酶A(palmitoyl COA，上海金穗生物科技有限公司)，軟脂酰肉毒堿(paimitoyl carnitine)、魚藤酮、表面活性劑(Triton WR-1339)、TritonX-100均由美國Sigma公司生產(chǎn)，其余試劑均為分析純。

1.1.3 試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、游離脂肪酸(FFA)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 主要儀器 離心機、 UniCel DxC 800Synchron全自動分析儀，均為美國貝克曼Beckman coulter公司。

1.2 動物分組及造模 取雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，即健康對照組、模型組及西紅花酸組，每組各10只。健康對照組予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，0.9%氯化鈉注射液15mL/(kg·d)灌胃10周。模型組和西紅花酸組予高脂飼料飼養(yǎng)(廣州啟正化工科技有限公司提供，含10%豬油、37%蔗糖和2%膽固醇)10周，同時前4周予20%乙醇15mL/(kg·d)灌胃，后6周改為50%乙醇15mL/(kg·d)灌胃。在此期間，西紅花酸組予西紅花酸50mg/(kg·d)灌胃進(jìn)行預(yù)防性治療。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血清ALT、TG含量及肝臟極低密度脂蛋白(VLDL)分泌速率測定 各組大鼠末次給藥后禁食8 h，眼眶取血，1500r/min，離心5min獲得血清，按試劑盒方法測定血清ALT、TG。靜脈注射 Triton WR-1339，于注射前(TG0)、注射后45min和90min(TG1)眼眶取血測定TG水平，通過測定不同時間點血漿TG含量，計算VLDL分泌速率。VLDL分泌速度計算公式：VLDL=(TG1- TG0)/T×(0.0276×BW+3.380)×60，其中T為90min，BW為小鼠體質(zhì)量[7]。

1.3.2 肝質(zhì)量系數(shù)、肝臟TG和FFA含量測定 各組大鼠斷頭處死，取肝臟稱質(zhì)量，計算肝質(zhì)量系數(shù)[計算公式為：肝質(zhì)量系數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%]。肝組織按質(zhì)量體積比1g∶9 mL加入0.9%氯化鈉注射液于冰浴中制成勻漿，取0.1mL勻漿，加入0.9 mL脂質(zhì)抽提液，混勻，渦旋，3500r/min，離心15min，取0.5mL，有機相，用氮氣吹干，加入異丙醇250μL，溶解，按試劑盒方法測定肝臟TG和FFA。

1.3.3 肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率和脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率測定 按照文獻(xiàn)[8]方法測定脂肪酸線粒體β-氧化速率，按照文獻(xiàn)[9]方法測定脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率。

1.3.4 苯胺羥化酶(ANH)、乙醇脫氫酶(ADH)及乙醛脫氫酶(ALDH)活性測定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]方法測定ANH活性。肝組織按1g∶9 mL加入預(yù)冷0.01mmol/L Tris液，勻漿，1500r/min 離心10min，取上清液，10000r/min 離心15min，取上清液，按試劑盒方法測定ADH活性。按參考文獻(xiàn)[11]方法測定ALDH活性。

1.3.5 肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量測定 取肝臟勻漿，SOD的測定方法參考文獻(xiàn)[12]，GSH的測定方法參考文獻(xiàn)[13]，MDA含量測定參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.6 肝臟病理學(xué)檢測 取各組大鼠肝臟右葉，用4%甲醛溶液固定，經(jīng)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠血清ALT和TG、肝臟TG和FFA含量及肝質(zhì)量系數(shù)比較 見表1。

組 別n血清ALT(U/L)血清TG(mmol/L)肝臟TG(mmol/L)肝臟FFA(mmol/L)肝質(zhì)量系數(shù)(%)健康對照組1051．3±4．22．44±0．212．51±0．262．31±0．322．37±0．12模型組1095．6±10．3?6．79±1．02??5．30±1．05??4．03±1．51??4．98±1．11?西紅花酸組1065．7±8．7?△3．99±0．57?△3．43±0．71?△3．08±0．27?3．83±0．66?△

與健康對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表1可見，與健康對照組比較，模型組大鼠血清ALT和TG含量、肝臟TG和FFA含量、肝質(zhì)量系數(shù)均升高，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而西紅花酸組均低于模型組(P<0.05)，但仍高于健康對照組(P<0.05)。

2.2 3組大鼠肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率、脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率及VLDL分泌速率比較 見表2。

組 別n肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率[nmol/(5min·mg)]肝臟脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率[nmol/(min·mgpro)]VLDL分泌速率[mmol/(L·min)]健康對照組103．3±0．22．5±0．30．46±0．1模型組101．9±0．5?1．4±0．2??0．21±0．4??西紅花酸組102．4±0．1?△1．5±0．9?0．23±0．2?

與健康對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表2可見，模型組及西紅花酸組大鼠肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率、脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率及VLDL分泌速率均較健康對照組降低(P<0.05，P<0.01)，而西紅花酸組肝臟脂肪酸線粒體β-氧化速率高于模型組(P<0.05)，脂肪酸過氧化物酶體β-氧化速率和VLDL分泌速率與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2.3 3組大鼠ANH、ADH及ALDH活性比較 見表3。

組 別nANH[nmol/(min·mg)]ADH(U/mg)ALDH(U/mg)健康對照組109．54±1．2340．61±5．0326．55±7．61模型組1015．39±2．50?18．44±7．12??15．33±3．94??西紅花酸組109．90±1．91△35．5±8．09△18．19±2．99△

與健康對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表3可見，與健康對照組比較，模型組ANH活性升高(P<0.05)，ADH及ALDH活性降低(P<0.01)；而西紅花酸組ANH活性較模型組降低(P<0.05)，ADH及ALDH活性升高(P<0.05)，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 3組大鼠肝臟MDA、GSH含量及SOD活性比較 見表4。

組 別nMDA(nmol/mg)GSH(U/g)SOD(U/mg)健康對照組103．57±1．53180．9±25．8126．6±17．1模型組1012．19±1．40?138．4±17．1??105．3±13．4??西紅花酸組104．10±1．05△175．5±10．9△119．9±12．9△

與健康對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表4可見，與健康對照組比較，模型組MDA含量升高(P<0.05)，GSH含量及SOD活性降低(P<0.01)；而西紅花酸組MDA含量較模型組降低(P<0.05)，MDA含量及SOD活性升高(P<0.05)，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 3組大鼠肝臟病理學(xué)比較 健康對照組可見正常肝細(xì)胞(見封3，圖1)。模型組可見大量脂質(zhì)沉積，脂肪變性細(xì)胞(見封3，圖2)。西紅花酸組可見脂質(zhì)沉積，脂肪變性，但程度較模型組輕(見封3，圖3)。

3 討 論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化功能的作用，對心血管、肝腎功能均有保護(hù)作用[15-16]。文娜等[16]通過對大鼠心肌缺血再灌注損傷造模，同時給予西紅花酸預(yù)防治療發(fā)現(xiàn)，其對心肌損傷有到一定的改善作用，其作用機制可能是增加缺血心肌能量物質(zhì)含量，保護(hù)ATPase活性，進(jìn)而改善能量代謝障礙。劉同征等[17]通過對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血研究發(fā)現(xiàn)，西紅花酸通過降低血清肌酸激酶、低密度脂蛋白的釋放，以及MDA水平而抑制心肌水腫，保護(hù)心肌。

酒精性脂肪肝發(fā)病機制主要是乙醇在體內(nèi)代謝過程中生成的乙醛量增加，使二羧酸循環(huán)受到抑制，脂肪酸氧化能力降低，導(dǎo)致脂肪代謝和轉(zhuǎn)運紊亂。因此，加速乙醛代謝，降低肝臟中FFA和TG含量，可減少脂肪在肝中的沉積，減輕脂肪肝發(fā)生程度。西紅花酸可清除羥自由基，抑制紅細(xì)胞溶血，并降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA，對肝線粒體誘導(dǎo)氧化引起的MDA產(chǎn)生有明顯抑制作用，由此增強脂肪酸的氧化和外排。

本實驗通過對大鼠酒精性脂肪肝造模，同時給予西紅花酸預(yù)防治療，并對肝細(xì)胞線粒體和過氧化物酶體2個指標(biāo)進(jìn)行檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西紅花酸能夠增強脂肪酸線粒體β-氧化活性，而對過氧化物酶體系統(tǒng)和VLDL分泌速度沒有明顯影響，說明西紅花酸對于酒精性脂肪肝的改善作用來源于對線粒體脂肪酸氧化系統(tǒng)的活化，而與過氧化物酶體以及VLDL的外排沒有關(guān)系，這與施韻等[18]得出的結(jié)論一致。同時，本實驗通過對血清及肝臟中TG的檢測發(fā)現(xiàn)，西紅花酸對TG的消除具有增強作用，其作用機制主要是通過降低脂蛋白酶抑制因子載脂蛋白-C的水平，提高了肝臟脂蛋白酶活性，增強血漿中TG消除速度，最終降低血清TG水平。有研究表明，西紅花酸可激活過氧化物酶增殖體激活受體-α(PPARa)活性，而PPARa活性的升高造成肝臟脂蛋白酶表達(dá)的增強和載脂蛋白-CⅢ表達(dá)水平的下降，這與本研究結(jié)果一致[19]。

綜上所述，西紅花酸不僅可改善心腦血管損傷，還可改善酒精性脂肪肝，其作用機制是通過加速肝臟線粒體脂肪酸氧化，增強ALDH活性，進(jìn)而加速乙醇和乙醛的清除。同時，通過降低脂蛋白酶抑制因子載脂蛋白-C的水平，提高了肝臟脂蛋白酶活性，增強血漿中TG消除速度，最終降低血中TG水平，減輕肝臟脂肪堆積。

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(本文編輯：曹志娟)

Studyofmechanismofactionforcrocetinonalcoholicfattyliverrats

WANGJianmin,LIWei,LIUJiang.

DepartmentofPharmacology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

ObjectiveTo investigate the improving effect of crocetin in rats with alcoholic fatty liver，and to elucidate the possible mechanism.Methods30SD rats were randomly divided into three groups, health control group, model group and crocetin group.Rats in model group andcrocetin group were prepared alcoholic fatty liver model by feeding high lipid diet plus alcohol for10weeks.Rats in crocetin group

crocetin [50mg/ (kg·d)] by intragastric administration.Then，liver index，TG, FFA, rate of VLDL-secretion, activity of aniline hydroxylase (ANH),alcohol dehydrogenase (ADH), aldenhyde dehydrogenase (ALDH), SOD and MDA were measured．Alanine aminotransferase (ALT) activity and TG concentration in serum andpathological changes in liver were also observed.ResultsThe contents of ALT and TG inserum, TG and FFA content of liver and liver weight coefficient in model group and crocetingroup were higher than those in health control group (P<0.01,P<0.05).Those in crocetin group were lower than those in model group (P<0.01,P<0.05).Fatty acid mitochondria beta oxidation rate, the peroxisomal beta oxidation rate and VLDL-secretion rate in model group and crocetingroup were lower than those in healthy controls (P<0.01,P<0.05).Fatty acid mitochondria beta oxidation rate in crocetin group was higher than that in model group (P<0.05).Compared with those in health control group, ANH activity and MDA concentration were increased in model group (P<0.05).The activities of ADH, ALDH and SOD and GSH concentration were decreased (P<0.01).ANH activity and MDA concentration in crocetin group were decreased in comparison with those in model group (P<0.05).The activities of ADH, ALDH and SOD and GSH concentration were increased (P<0.05).ConclusionCrocetin can improve alcoholic fatty liver rats.This effect relates to the increase of liver mitochondrial fatty acid oxidation，reduction of fatty sediment，inhibition of lipid peroxidation，and acceleration of the elimination of alcohol and aldehyde．

Alcoholic fatty liver; Crocetin; Disease model; Animal; Experiment

王建敏(1972—)，女，主管護(hù)師，學(xué)士。研究方向：藥學(xué)。

R965．1；R975．5

A

1002-2619(2014)11-1703-04

2014-02-28)