楊柏林，高亞麗，姜玲玲，剛 錳，熊德琪

(大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，遼寧 大連 116026)

消油劑和120#燃料油對海膽DNA損傷及甲基化影響*1

楊柏林，高亞麗，姜玲玲，剛 錳，熊德琪*

(大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，遼寧 大連 116026)

利用120#燃料油分散液和消油劑處理的乳化液測定海膽急性毒性和慢性DNA損傷及全基因組甲基化水平變化，確定消油劑處理的120#燃料油對海膽的毒性影響。結(jié)果表明：消油劑單獨使用對海膽的影響微乎其微，經(jīng)消油劑處理的燃料油乳化液中的多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度明顯高于分散液中的質(zhì)量濃度；乳化液和分散液對海膽都有明顯的毒性作用，其96 h半數(shù)效應濃度(EC50)值分別為12.03 g/L和29.15 g/L；DNA損傷研究表明，乳化液處理的海膽腸細胞彗星拖尾情況比同質(zhì)量濃度分散液中拖尾情況更加嚴重；全基因組甲基化水平比分散液中更低，表明乳化液的急性毒性更大，所造成的DNA損傷更加嚴重。結(jié)果提示消油劑的使用會增大燃料油對海膽的毒性效應。

消油劑；120#燃料油；海膽；DNA損傷；甲基化

石油泄漏對當?shù)氐闹参锶汉蛣游锶旱挠绊懯菫碾y性的[1-3]。目前，處理溢油的主要措施為物理去除和化學分散相結(jié)合的處理措施?；瘜W分散主要憑借消油劑中的表面活性劑組分的作用，而消油劑的化學分散只會將水體表面的油膜分散成微小油滴進入水體中[4]。然而，在近岸區(qū)域消油劑的使用就不存在優(yōu)點了，在近岸由于水體中的油滴不容易受到稀釋，可以引起敏感生態(tài)系統(tǒng)短時間內(nèi)暴露于高濃度石油污染之下，從而對海洋環(huán)境造成致命的損害。

目前，國外對于消油劑和溢油的聯(lián)合毒性方面研究比較重視，主要研究對象為魚類、藻類和貝類等物種，而且研究普遍認為消油劑的使用會增大溢油的生態(tài)污染，如:Shahunthala等[5]用不同鹽度的海水測定化學分散原油對虹鱒魚的影響，實驗證明了化學分散原油增加了多環(huán)芳烴對魚類的暴露機會[6]，比較48 h的半數(shù)效應濃度(EC50)時，得出投加化學分散劑的原油的EC50值遠遠小于未投加分散劑的EC50值。 Milinkovitch[7]在化學分散油對薄嘴鯔的幼魚的生物積累和死亡率影響的研究中發(fā)現(xiàn)，化學分散油相比未經(jīng)消油劑處理的油滴具有更大的多環(huán)芳烴濃度，以及更高的致死率；在湍流混合區(qū)消油劑的應用會增大對水體生物的環(huán)境風險。國內(nèi)目前對消油劑的研究大多為對浮游生物的研究，黃逸君等[8]、張蕾等[9]和徐會等[10]研究了消油劑及原油對橈足類和浮游植物的急性毒性效應，對底棲生物的研究也是研究輕質(zhì)柴油居多[11-13]，在消油劑和重質(zhì)燃料油復合效應方面的研究明顯不足。而僅僅少數(shù)學者認為消油劑的使用會降低石油污染的生物效應。為了確定消油劑和石油污染的毒性作用機制，評價兩者的聯(lián)合毒性效應，有必要做進一步的生物毒性研究。

本研究選擇比較常見的船舶燃料120#燃料油，主要目的通過研究重質(zhì)船舶燃料油的機械分散液和消油劑分散的乳化液對海膽的96 h急性毒性及21 d DNA損傷情況、全基因組甲基化水平，來評價重質(zhì)燃料油和消油劑對底棲生物海膽的毒性影響。以便為近岸溢油處理提供理論數(shù)據(jù)，為建立近岸地區(qū)消油劑使用政策提供一個全面的框架。

1 材料和方法

1.1 材 料

1)受試生物：馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)購自大連海寶海珍品有限公司，平均直徑3.5 cm，體重(11.4±0.8) g。將受試海膽在實驗室內(nèi)室溫(18±0.5) ℃暫養(yǎng)一周后，選擇正常健康個體，按照不同培養(yǎng)液濃度分組分別進行實驗，每個濃度組設置3個平行組，每個平行組中3個個體。

2)待測油品： 120#船舶燃料油由大連船舶燃料油公司提供。溢油分散劑：“919”型消油劑。

1.2 方 法

1)分散液和乳化液的制備

(1)分散液的配置：

選用容量為2 L的大燒杯，放入轉(zhuǎn)子，加入一定比例的燃料油和過濾海水，燒杯口用保鮮膜和錫紙密封，然后用磁力攪拌器進行恒速攪拌24 h，攪拌結(jié)束后再靜止4 h，除去表面油膜即為分散液。

(2)乳化液的配置：

在水體中加入和分散液對應實驗組等量的燃料油，并加入燃料油投放量20%的消油劑，其他條件和配置分散液相同。

2)急性暴露：海膽在毒性暴露前24 h停止餌料投喂，暴露過程中不進行喂食。根據(jù)預實驗設定分散液質(zhì)量濃度為5，10，20，40和80 g/L；乳化液質(zhì)量濃度2.5，5，10，20和40 g/L。觀察并記錄海膽暴露96 h的狀態(tài)，將附著能力下降、刺體脫落及死亡個體記為受抑制海膽。

3)慢性暴露：根據(jù)預實驗設定質(zhì)量濃度4.50,2.25,1.13,0.56,0.28 g/L,對海膽進行7，14和21 d的暴露實驗。將實驗分為3組進行：第1組為對照組(海水對照和消油劑海水對照組)；第2組為海水和120#燃料油分散液實驗組；第3組為海水、消油劑和120#燃料油組成的乳化液實驗組。暴露過程中，每隔1 d更換一次受試溶液，并進行投餌，每天光照時間為12 h，對海膽的異常發(fā)育情況進行觀察拍照。

4)DNA損傷測定(單細胞凝膠電泳SCGE)：暴露7，14和21 d的海膽，將其腸組織的細胞制成單細胞懸液，然后進行制片，采用三層“漢堡式”鋪片法，第1層和第3層為正常熔點的瓊脂糖，中間層為含有腸組織單細胞懸液的低熔點瓊脂糖。制片后，4 ℃下裂解2 h，然后解旋20 min。DNA解旋完成后進行30 min低溫電泳，電泳后取片中和15 min，最后進行EB染色并在熒光顯微鏡下觀察拍照。

5)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用海膽組織及分散液和乳化液樣品的預處理

(1)萃取：取0.05 g海膽腸組織(分散液和乳化液的預處理時，萃取體積取2 mL)，用乙酸乙酯/正己烷混合液萃取3次：第1次加3 mL混合液，混勻床震蕩30 min后，抽取萃取液；第2次和第3次分別加2 mL混合液，重復上述步驟。

(2)過柱：稱取5.5 g硅膠、無水硫酸鈉和正己烷進行裝柱，用膠頭滴管將萃取液加入玻璃層析柱中，放空。再加入正己烷/二氯甲烷混合液40 mL，放空。

(3)旋蒸：在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將過柱后的樣品溶液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至溶液殘余表面直徑為2.5 cm大小。用膠頭滴管取出剩余溶液置于試管中，再加正己烷潤洗旋蒸瓶，將剩余液也置于試管中。

(4)氮吹：將上述試管中的溶液在氮吹儀器上吹至1 mL以下，然后再用異辛烷定容至1 mL。

(5)裝瓶標號：將最后定容的1 mL樣品裝入色譜專用瓶中，進行編號，并置于-20 ℃保存，上機測定。

6)氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀選用美國Agilent公司生產(chǎn)的7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，具體條件如下：

載氣：He；流量：0.8 mL/min；色譜柱：HP-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣方式：自動、不分流；進樣量：0.2 μm；進樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：250 ℃；柱溫程序：初始 50 ℃恒溫l min后以80 ℃/min的速率升溫至280 ℃恒溫10 min，再以 10 ℃/min的速率升溫至300 ℃，恒溫保持10 min。離子化方式：EI；離子化能量：70 eV；離子化電流：300 μA；離子源溫度：200 ℃；掃描范圍 ：50～550 amu自動調(diào)諧；質(zhì)譜檢索：采用NIST98譜庫檢索。

7)甲基化實驗

(1)樣品預處理：將暴露于不同污染條件下的海膽組織進行DNA提取，DNA提取方法采用經(jīng)典的酚仿抽提法，為了去除RNA對DNA提取結(jié)果的影響，利用核酸酶T1和核酸酶A對DNA進行純化，將25 μL體積分數(shù)為70%的HClO4與純化的50 μL DNA進行混合，在水浴鍋中進行水解(80 ℃)，水浴時間為5 h，用 2 mol/L KOH將混合液的pH值控制在3～5，調(diào)節(jié)pH過程中，由于HClO4和KOH反應會有白色沉淀(KClO4)產(chǎn)生，反應結(jié)束后在低溫(-20 ℃)靜置12 h。將處理好的DNA在離心機中離心(轉(zhuǎn)速為12 000 r/min)30 min，并提取上清液。經(jīng)上述處理的DNA直接加入到高效液相色譜儀中進行樣品測定。

(2)色譜條件：

液相色譜選擇美國Water公司生產(chǎn)的Waters 2489型高效液相色譜儀，具體色譜條件如表1所示。

表1 色譜條件Table 1 Chromatographic conditions

將柱子用體積分數(shù)40%的甲醇沖洗30 min，再用體積分數(shù)10%的甲醇沖洗30 min，最后用流動相平衡基線。開始進樣測定，樣品的上樣量為10 μL。首先用標準品確定標準溶液中兩種組分：胞嘧啶(dC)和5-甲基胞嘧啶(5-dmC)的保留時間和峰面積；將未知樣品進樣，通過與標準品峰型作比較，確定被測溶液中所含的兩種待測成份(dC)和(5-dmC)的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1)急性毒性的實驗數(shù)據(jù)通過軟件Origin 8.0對急性毒性數(shù)據(jù)散點平均值進行非線性擬合，并得出擬合函數(shù)，通過相應的擬合函數(shù)計算出96 h 的EC50值。

2)用ACDSEE9.0軟件將彗星照片轉(zhuǎn)換為400像素×300像素大小，格式為TIFF，然后用CASP彗星圖像分析軟件(http:∥www.casp.of.pl)自動分析，分析指標為尾長(TL)、尾部DNA百分量(TDNA%)。

3)根據(jù)dC和5-dmC的分子量，把以上兩物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度，計算每個樣品中5-dmC×100%/(dC+5-dmC)的比值，即為DNA甲基化水平。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 分散液和乳化液中燃料油水溶組分成分分析

在整個暴露過程中，空白對照組中沒有檢測到多環(huán)芳烴，而分散液和乳化液的水溶組分中的多環(huán)芳烴被檢測到并列于表2。由表2可以看出120#燃料油的分散液和乳化液中主要包含21種多環(huán)芳烴，而其中的16種多環(huán)芳烴(包括萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g,h,i)芘被美國環(huán)保局列為優(yōu)先污染物。對比分散液和乳化液中組分質(zhì)量濃度的變化可以發(fā)現(xiàn)，乳化液中多環(huán)芳烴的質(zhì)量濃度比分散液中質(zhì)量濃度有不同程度的增大。這些多環(huán)芳烴都是對生物造成毒性損害的潛在污染物。

表2 120#燃料油分散液和乳化液水溶組分中的多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons in the dispersion and emulsion of 120# fuel oil

2.2 急性毒性試驗結(jié)果

根據(jù)96 h幼海膽的狀態(tài)記錄，將質(zhì)量濃度log值和抑制率平均值分別作為橫縱坐標，繪制出120#燃料油質(zhì)量濃度抑制率曲線(圖1)，并選擇擬合率>99%的函數(shù)進行擬合，擬合結(jié)果列于表3。

圖1 120#燃料油分散液和乳化液對海膽的抑制率擬合結(jié)果Fig.1 Fitting results of inhibition rate of dispersion and emulsion of 120# fuel oil on sea urchin

表3 120#燃料油分散液和乳化液對海膽的96 h EC50值Table 3 96 h EC50 of dispersion and emulsion of 120# fuel oil on sea urchin

由表3可見，96 h 120#燃料油分散液和乳化液對海膽的EC50值分別是29.15和12.03 g/L,乳化液的EC50值比分散液的EC50值減小58.7%，說明在消油劑的作用下120#燃料油乳化液的毒性比分散液的毒性增大了1.42倍。

2.3 慢性毒性試驗結(jié)果

1)表觀中毒癥狀

暴露試驗過程中，在0，7，14和21 d，分別對不同分散液和乳化液質(zhì)量濃度的海膽狀態(tài)進行觀察：在0，7和14 d時，幼海膽本身無明顯的掉刺現(xiàn)象，空白組表現(xiàn)正常；21 d后，分散液中僅在高濃度組4.5 g/L開始出現(xiàn)掉刺現(xiàn)象，然而乳化液中質(zhì)量濃度在1.13，2.25和4.50 g/L組中，都分別出現(xiàn)不同程度的掉刺現(xiàn)象，而且海膽管足的附著能力也有不同程度的下降。具體形態(tài)變化情況如圖2。

圖2 暴露21 d海膽的形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of sea urchin within 21 d exposure

2)DNA損傷情況

暴露于分散液和乳化液中的海膽腸細胞的DNA損傷情況被繪于圖3。由圖3可以看出海膽腸細胞的DNA損傷程度隨著分散液和乳化液質(zhì)量濃度增大和暴露時間延長呈現(xiàn)明顯的正增長，但是在7和14 d時，燃料油分散液和乳化液中都出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，但是尾部DNA百分含量均<5%，而21 d時，分散液中最高質(zhì)量濃度組4.5 g/L出現(xiàn)尾部DNA百分含量大于5%的情況，而乳化液中較高濃度組2.25 g/L和最高質(zhì)量濃度組4.5 g/L均出現(xiàn)尾部DNA百分含量大于5%的損傷情況，并且質(zhì)量濃度為4.5 g/L時，尾部DNA百分含量達到最大為17.28%，說明乳化液海膽腸細胞損傷程度高于分散液。

大量的研究結(jié)果得出一致結(jié)論，包括物理因素(紫外線和冷凍)和化學因素(有毒化學物質(zhì)及氧化劑)等[14-15]都有可能引起 DNA 單鏈斷裂，造成不同程度的遺傳損傷。而多環(huán)芳烴具有遺傳毒性，可以通過氧化還原形成活性氧(ROS)并與DNA結(jié)合形成DNA加和物，從而更能引起DNA單鏈斷裂，造成DNA損傷。一些研究已經(jīng)證明了多環(huán)芳烴可以誘導海洋生物的DNA損傷，Humphries等[16]通過檢測暴露于多環(huán)芳烴中不同發(fā)育時期的貽貝的DNA損傷情況，發(fā)現(xiàn)貽貝暴露7 d后的DNA損傷程度隨著多環(huán)芳烴濃度的增大而增大；Woo等[17]在研究多環(huán)芳烴暴露過程中牙鲆魚血細胞的DNA損傷情況時也發(fā)現(xiàn)，DNA損傷情況與多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度和暴露時間密切相關。本研究中DNA損傷在120#燃料油乳化液中更為明顯，可以認為主要是由于消油劑的存在使乳化液中多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度增大，從而對海膽誘導了海膽腸細胞的DNA損傷。

圖3 不同質(zhì)量濃度、不同暴露時間海膽腸組織DNA損傷情況Fig.3 DNA damage of intestinal tissue of sea urchins in different concentration within different exposure time

注：n=5，“a”與對照組相比，差異顯著P<0.05；“aa”與對照組相比，差異顯著P<0.01；“b”與分散液相比，有明顯差異，P<0.05；“bb”與分散液相比，差異顯著，P<0.01

3)全基因組甲基化水平

在暴露時間點7，14和21 d，分別對海膽組織的5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶進行測定，并計算出相應的甲基化水平(圖4)?？瞻捉M在不同的培養(yǎng)天數(shù)下，甲基化水平在14%左右；而毒性暴露7 d時，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度的分散油和乳化油的暴露，除個別質(zhì)量濃度外，海膽組織的整體甲基化水平呈不同程度的下降趨勢，并且乳化液中海膽組織甲基化程度比分散液中更低；染毒14 d時，分散液和乳化液中海膽組織甲基化水平相較7 d時有所升高，但是乳化液中的甲基化水平依然低于分散液中的甲基化水平；染毒21 d時，分散液中甲基化水平?jīng)]有明顯的變化規(guī)律，而乳化液中甲基化水平相較14 d時有明顯的降低。

圖4 不同暴露時間、不同質(zhì)量濃度分散液和乳化液中海膽甲基化水平Fig.4 Whole genome-wide methylation levels of sea urchin in different concentration within different exposure time

注：n=3，“a”與對照組相比，差異顯著P<0.05；“aa”與對照組相比，差異顯著P<0.01；“b”與分散液相比，有明顯差異，P<0.05；“bb”與分散液相比，差異顯著，P<0.01

總之，DNA 甲基化水平的影響與作用時間和污染濃度有關, 120#燃料油乳化液中海膽組織細胞DNA 最終維持非正常低度甲基化，這可能與氧化脅迫下生物體的自身調(diào)控有關。有報道指出污染物達到一定質(zhì)量濃度可以對水生生物甲基化水平產(chǎn)生影響， Aniagu等[18]證實DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR 可以顯著降低魚體內(nèi)肝組織的甲基化水平；周新文[19]和Rossiello等[19-20]證實重金屬也能引起DNA低度甲基化；Fang等[21]證實多環(huán)芳烴能夠抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活力,從而影響生物發(fā)育。120#燃料油含有21種多環(huán)芳烴，海膽暴露于燃料油分散液和乳化液中21 d，進入海膽體內(nèi)的多環(huán)芳烴在海膽體內(nèi)積累并且抑制了甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而抑制了胞嘧啶的正常甲基化。分散液中暴露21 d，海膽的甲基化程度趨于正?？赡芘c海膽自身的修復有關，而燃料油乳化液中DNA甲基化明顯低于正常甲基化水平，可能由于消油劑的作用使油滴更容易滲透到海膽體內(nèi)，造成海膽自身不可修復的影響。可認為DNA在石油烴影響下的低度甲基化是對水生生物基因毒性的一種機制。

DNA甲基化改變作為表觀遺傳學主要的研究機制之一，DNA甲基化水平異常會引起基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化程度調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；可能產(chǎn)生可遺傳的新表型，而降低環(huán)境適應能力。海膽的慢性中毒癥狀可能是由于DNA甲基化抑制防御外源污染物的相關基因表達引起的，也可能與基因突變相關。關于這一結(jié)論需要進一步的實驗進行驗證。

3 結(jié) 論

1)急性毒性實驗：消油劑本身對海膽屬于微毒性；120#燃料油分散液和乳化液對海膽的96 h EC50值分別是29.15和12.03 g/L,120#燃料油乳化液的毒性比分散液的毒性明顯增大；

2)慢性毒性實驗：毒性效應和甲基化水平同時表明120#燃料油分散液和乳化液對海膽有明顯的毒性影響；在分散液和乳化液中海膽腸細胞都出現(xiàn)了一定程度的DNA損傷，并且損傷程度隨著暴露時間的延長更加嚴重，乳化液中的DNA損傷程度高于分散液中的損傷程度，當分散液和乳化液的質(zhì)量濃度均達到4.5 g/L時，分散液中彗星拖尾尾部DNA百分含量最大值是5.49%，而乳化液中的尾部DNA百分含量最高達到17.28%；海膽的全基因組甲基化水平在燃料油分散液和乳化液暴露后相比于正常發(fā)育的海膽都有明顯的降低，乳化液濃度與甲基化水平呈負相關，乳化液最高質(zhì)量濃度4.5 g/L時，甲基化水平達到最低為6.78%。

上述結(jié)論是在實驗室條件下模擬海洋溢油時，得到的消油劑和石油烴對海洋底棲生物的污染情況。以上結(jié)論提醒我們，在消油劑使用之前必須要謹慎考慮這些數(shù)據(jù)。慢性毒性引起的甲基化水平的變化對相關基因表達的影響有待在后續(xù)實驗中進一步確定。

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TheEffectofDispersantand120#FuelOilonDNADamageandDNAMethylationofSeaUrchin

YANG Bai-lin, GAO Ya-li, JIANG Ling-ling, GANG Meng, XIONG De-qi

(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,DalianMaritimeUniversity, Dalian, 116026, China)

The impact of 120#fuel oil and dispersants on sea urchin was studied by determining the acute toxicity, DNA damage and DNA methylation level. The results showed that: using dispersant alone had little effect on sea urchin, but the concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbon in oil emulsion added with dispersant were significantly higher than those in oil dispersion; Oil dispersion with dispersant had obvious effect of toxicity, the 96 h EC50value was 12.03 g/L in oil emulsion compared to 29.15 g/L in oil dispersion; DNA damage in intestinal cells treated with oil emulsion was more serious than that with oil dispersion; DNA methylation in whole genome level had declined in both oil dispersion and oil emulsion, the methylation lever was lower in oil emulsion and had a higher acute toxicity. All these suggest that the application of dispersants increased the toxic effects of fuel oil on sea urchin.

Dispersant; 120#fuel oil; Sea urchin; DNA damage; DNA methylation

September 4, 2013

2013-09-04

國家自然科學基金項目——消油劑處理溢油對模式生物海膽的聯(lián)合毒性效應及機制研究(41276105);中華環(huán)境保護基金會——格平綠色助學行動——遼寧環(huán)境科研教育“123”工程

楊柏林(1985-) ,男,河北秦皇島人,博士研究生，主要從事環(huán)境規(guī)劃管理方面研究. E-mail：yangbailin-peanut@163.com

*通訊作者，E-mail:xiongdq@dlmu.edu.cn

(王佳實 編輯)

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A

1671-6647(2014)03-0387-09