張文杰 馮巖 王智華 張哲 馮志山

·論著·

肺炎患兒外周血T淋巴細胞表型分析

張文杰 馮巖 王智華 張哲 馮志山

目的探討肺炎患兒外周血淋巴細胞膜上CD+3, CD+3CD+4,CD+3CD+8及CD+4CD+25(調(diào)節(jié)性T細胞,regulatory T,Treg)的分布情況，了解患兒的機體免疫功能與肺炎的關(guān)系及調(diào)節(jié)性T細胞在肺炎患兒中的表達情況。方法采用流式細胞術(shù)分析75例肺炎患兒(試驗組)外周血淋巴細胞中CD+3, CD+3CD+4，CD+3CD+8及CD+4CD+25表達情況并與30例健康對照進行比較。結(jié)果試驗組CD+3，CD+3CD+8細胞均低于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；試驗組CD+3CD+4, CD4/CD8均低于對照組，試驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；試驗組CD+4CD+25表達大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論肺炎患兒CD+3,CD+3CD+4,CD+3CD+8細胞表達均低于對照組，CD4/CD8比值降低，調(diào)節(jié)性T細胞在肺炎患者外周血細胞中的表達均高于正常對照，肺炎患兒存在免疫功能異常。

肺炎；CD3+；CD3+CD4+；CD3+CD8+； CD4+CD25+；流式細胞術(shù)

肺炎是小兒所患疾病中的常見病、多發(fā)病，由于兒童期機體各項機制發(fā)育還不完善，尤其是在冬春季節(jié)，由于空氣氣溫、濕度變化較大，空氣污染等原因，兒童非常容易發(fā)生肺炎，嚴重影響兒童的身體健康，它是一類感染性疾病，主要病因是由病毒或細菌及支原體感染[1]，若治療不及時可能會給患兒帶來終生傷害，而現(xiàn)階段治療小兒肺炎的主要方法為經(jīng)靜脈滴注治療藥物，本文利用流式細胞術(shù)分析了肺炎患者及健康人外周血T淋巴細胞的表型分類，以探討各型T淋巴細胞在炎癥發(fā)生時機體內(nèi)的變化及可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6月至2013年12月我院收治的肺炎患者75例，均為初診患者，其中男40例，女35例；年齡1～7歲，平均年齡(4.6±3.1)歲；設為試驗組；健康對照(均為兒保體檢者)30例，男17例，女13例；年齡1～6.5歲，平均年齡(3.9±2.2)歲；設為對照組。2組性別比及年齡均匹配，2組資料中的個體均無免疫功能缺陷及過敏性疾病史，近期未使用影響免疫功能的藥物或制劑。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器設備： 流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的Epics XL型；移液器為DRAGEN，刻度分別為5～20 μl和21～100 μl,101～1 000 μl三種可調(diào)式加樣器；離心機為白洋離心機廠生產(chǎn)的醫(yī)用低速離心機；混旋器為XK 96-A快速混勻器，由姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；冰箱為日本東芝公司生產(chǎn)。用于分析T淋巴細胞表型的試劑分別為CD45FITC-CD4PE-CD8ECD-CD3PC5、CD4 FITC、CD25 PE標記，這些均為鼠抗人抗體，溶血素為OPTILYSE-C，它們均為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。

1.2.2 試驗方法：均空腹采集健康體檢者與肺炎患者外周血液2ml，EDTA-K2抗凝，首先對每例外周血標本白細胞進行計數(shù)，確保符合要求[白細胞計數(shù)范圍(4.0～10)×109個/L]，對于不能滿足此條件的標本用0.9%氯化鈉溶液進行稀釋或加大標本與抗體用量，取4支試管分別加入CD45FITC-CD4PE-CD8ECD-CD3PC5四色抗體及同型對照20 μl及CD25PE 20 μl-CD4FITC 20 μl，IGG1FITC-IGG2PE 20 μl(所有試劑均應在4℃冰箱保存，使用前取出，放至室溫后再進行細胞標記)，每管加入抗凝全血100 μl，渦旋震蕩器充分混勻，室溫(20～25℃)避光孵育15～20 min，然后每管加入500 μl OPTILYSE-C溶血素，震蕩混勻，室溫避光孵育10 min，每管加入0.9%氯化鈉溶液500 μl，混勻，室溫避光放置10 min，以1 500 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入1 ml緩沖液重懸細胞，用于流式細胞儀計數(shù)分析，所有樣本均在采集后2 h內(nèi)標記完畢，24 h內(nèi)上機獲取分析，以同型對照設定獲取條件，所有實驗均在相同條件下進行，至少獲取10 000個細胞。

2 結(jié)果

表1 2組，數(shù)據(jù)變化比較

3 討論

1 Naheed A,Saha SK,Breiman RF,et al.Multihospital surveillance of pneumonia burden among children aged <5 years hospitalized for pneumonia in Bangladesh.Clin Infect Dis,2009,48:82-89.

2 Jacalyn I.Risk factors and interventions for ventilator associated pneumonia among ventilated pediatric intensive care unit patients.J Pediatr Nursing,2010,25:17.

3 Roe MF,Bloxham DM,White DK,et al.Lymphocyte apoptosis in acute respiratory syneytial virus bronchiolitis.Clin Exp Immunol,2004,137:139-145.

4 Hayakawa M，Taguchi H，Kamiya S，et al.Animal model of mycoplasma pneumoniae infection using germ-free mice.Clin Diagn Lab Immuno，2002，9：669-676.

5 Itoh M,Takahashi T,Sakaguchi N,et al.Thymus and autoimmuni-ty:production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive Tcells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-toleranceCD4+CD25+T.J Immunol,1999,162:5317-5326.

6 Fontenot JD,Rasmussen JP,Gavin MA,et al.A function for interleukin2 in Foxp3-expressing regulatory T cells.Nat Immunol,2005,6:1142-1151.

7 De la Rosa M,Rutz S,Dominger H, et al.Interleukin-2 is essential for CD4+CD25+ regulatory T cell function .Eur J Immunol,2004,34:2480-2488.

8 Schulze ZUR,Wiesch J,Thomssen A,et al.Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FOXP3 + Tregulatory cells correlates with progressive disease.J Virol,2011,85:1287-1297.

9 Sasada T,Kimura M,Yoshida Y,et al.CD4 + CD25 + regulatory T ce11s in patients with gastrointestinal malignancies： possible in-volvement of regulatory T cells in disease progression.Cancer,2003,98:10-89-1099.

10 Beecher-Allan C,Brown JA,Freeman GJ,et al.CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood .J Immunol,2001,167:1245-1253.

11 Yasutomo K.The cellular and molecular mechanism of CD4+/CD8+ lineage commitment J.Med Invest,2002,49：121.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.19.037

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學重點實驗室(張文杰、王智華、張哲)；河北聯(lián)合大學(馮巖)；河北省兒童醫(yī)院(馮志山)

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2014-06-20)