王獻(xiàn)偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

·論著·

血紅素加氧酶-1啟動(dòng)子基因多態(tài)性與食管鱗癌的相關(guān)研究

王獻(xiàn)偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

目的探討血紅素加氧酶-1(HO-1)基因啟動(dòng)子序列的(GT)n雙核苷酸重復(fù)多態(tài)性與食管鱗狀上皮癌的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)在93例食管癌患者和98例正常對(duì)照人群中檢測(cè)HO-1基因多態(tài)性，比較基因型及等位基因在2組的分布。結(jié)果2組人群在年齡、性別比、血糖、血脂水平分布無明顯差異；重復(fù) 32次的長(zhǎng)等位基因(L等位基因)的頻率在食管癌組要顯著高于對(duì)照組(26.9%比14.2%,P<0.05)。結(jié)論HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的(GT)n雙核苷酸重復(fù)多態(tài)性可能與食管鱗狀上皮癌的易感性相關(guān)。較長(zhǎng)的(GT)n重復(fù)等位基因HO-1啟動(dòng)子與食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，而較短(GT)n重復(fù)等位基因可能在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)生起保護(hù)作用。

血紅素加氧酶；基因多態(tài)性；食管腫瘤

血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解代謝過程中的一種限速酶，HO的作用之一是可將血紅素分解為一氧化碳(carbon monoxide，CO)、Fe、膽綠素。HO-1的產(chǎn)生過程是一種對(duì)有害性刺激的適應(yīng)性及保護(hù)性反應(yīng),并與臨床上某些相關(guān)疾病密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中普遍呈高表達(dá)狀態(tài)。近年來有研究表明，HO與腫瘤的增殖、血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)。HO-1基因啟動(dòng)子有一雙核苷酸(GT)n重復(fù)序列，具有較高的多態(tài)性，能影響其基因的轉(zhuǎn)錄活性。通過體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定(GT)n重復(fù)次數(shù)，能間接了解機(jī)體內(nèi)HO-1的遺傳表達(dá)程度。較長(zhǎng)的重復(fù)序列HO-1轉(zhuǎn)錄活性較低[1]，并且有報(bào)道較長(zhǎng)的重復(fù)序列(GT)重復(fù)增加心血管疾病的易感性，導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病，肺腺癌口腔癌等[2]。我們對(duì)食管癌患者和健康對(duì)照者的血紅素加氧酶-1基因啟動(dòng)子序列的(GT)n雙核苷酸重復(fù)多態(tài)性進(jìn)行了對(duì)照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本部分191例食管鱗癌患者中有完整病例資料，石蠟包埋組織塊(手術(shù)切除標(biāo)本或活檢標(biāo)本)及血樣標(biāo)本的共93例。所有病例均為39歲以上，年齡39～75歲,平均58.5歲。所有病例臨床資料完整,按照WHO 2003年AJCC第六版PTNM分期標(biāo)準(zhǔn)食管癌分期，11期25例，三期33例,四期35例。無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，有縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。高分化鱗中分化鱗癌42例，低分化鱗癌51例。對(duì)照組98例為同期所取經(jīng)檢測(cè)為健康的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取：采外周血2 ml(EDTA抗凝)，采用常規(guī)酚/氯仿法提取，用紫外光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，DNA純度=A260/A280，比值結(jié)果范圍為1.6～1.8，說明樣品DNA雜質(zhì)少，純度高；如果DNA純度<1.60，表明蛋白含量太高或者有殘存酚，需再提取純化。

1.2.2 HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)序列多態(tài)性分析：應(yīng)用PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)列GT重復(fù)數(shù)目。

1.2.3 PCR反應(yīng)：①引物設(shè)計(jì) (由上海生工生物工程公司合成)。上游引物P1：5’-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGA-3’下游引物P2：5’-ACAAAGTCTGGCCATAGGAC-3’②PCR反應(yīng)體系：采用50 μl反應(yīng)體系，每體系含ddH2O:36.5 μl;10×Buffer:5 μl;引物P1:1 μl;引物P2:1 μl;10 mmol/L dNTPs:1 μl;Taq酶：0.5 μl;基因組DNA2.0 μl。③PCR擴(kuò)增條件：95℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s；退火延伸72℃ 30 s，共31個(gè)循環(huán)。

1.2.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳：用TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠。在微波爐內(nèi)煮沸直至瓊脂糖溶解，待冷卻到60℃時(shí)，加入溴化乙錠(10 mg/ml)使其終濃度為0.5 mg/ml,混勻后灌膠。待膠凝固后放入含TAE電泳液的電泳槽內(nèi)，使TAE液蓋過凝膠。取10～15 μl提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液(含0.25%溴酚蘭，4%蔗糖)按4∶1比例混勻后點(diǎn)樣。60 V電泳1 h。

1.2.5 染色及結(jié)果鑒定：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入小托盤中，用全自動(dòng)凝膠成像儀觀察梯形條帶，并攝影記錄各標(biāo)本的基因型。

1.2.6 基因型的判定[3]：由于HO-1啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性是由雙核苷酸(GT)重復(fù)序列的數(shù)目不同而引起，是一種長(zhǎng)度重復(fù)的多態(tài)性，所以可以直接對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過捷達(dá)凝膠顯像系統(tǒng)來計(jì)算該電泳片段的總長(zhǎng)度，除去固定堿基序列的數(shù)目，即能推算出雙核苷酸重復(fù)的數(shù)目。查閱Genebank Accession Nos AF145047.1核對(duì)HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域基因序列發(fā)現(xiàn)兩引物之間共有127個(gè)序列5"-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGATTTCCTT’AAAGGTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAT；GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTCTCTAAA；AGTCCTATGGCCAGACTTTGT- 3’產(chǎn)物中GT重復(fù)兩端的固定序列長(zhǎng)度為:127-(30×2)=67(bp)。這樣推算出，GT重復(fù)次數(shù)=(產(chǎn)物長(zhǎng)度-67)/2。通過捷達(dá)凝膠顯像系統(tǒng)來計(jì)算其電泳片段的總長(zhǎng)度，除去固定堿基序列的數(shù)目，依次來推斷雙核苷酸重復(fù)的數(shù)目。根據(jù)重復(fù)次數(shù)的差別分為三種序列：重復(fù)次數(shù)≤25者為小量重復(fù)序列(S型位點(diǎn));重復(fù)次數(shù)處于26～30者為中量重復(fù)序列(M型位點(diǎn))；重復(fù)次數(shù)大于或等于31則為大量重復(fù)序列(L型位點(diǎn))。基因型的計(jì)算采用直接計(jì)數(shù)法，公式為等位基因頻率=(該基因純合子個(gè)體數(shù)×2+該基因雜合子個(gè)體數(shù))/總個(gè)體數(shù)×2。

2 結(jié)果

2.1 2組間年齡、性別比較 2組間年齡經(jīng)、性別構(gòu)成經(jīng)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組各項(xiàng)一般臨床數(shù)據(jù)比較

2.2 HO-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果 因?yàn)閯澐至巳N等位基因S、M、L所以得到六種基因型。見圖1。

2.2.1 基因型分布 HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)(GT)n重復(fù)序列在對(duì)照組和食管癌組中的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2.2 HO-1等位基因在對(duì)照組和食管癌組的分布 食管癌組的L等位基因頻率要明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.3 各基因型及等位基因在對(duì)照組及食管癌組中的分布比較 根據(jù)各基因的電泳結(jié)果，計(jì)數(shù)其基因型。

1，7：marker；2～6：SL，SL， ML， ML，LL；8～11：SL，SS，SM，SM
Marker條帶從小到大依次為67、110、147、190、242、331、404、489、451、692、881

圖1 HO-1基因PCR產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖像(10%)

表2 HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)在對(duì)照組和食管癌組的基因型分布 例

表3 對(duì)照組和食管癌組HO-1等位基因分布頻率比較 例(%)

3 討論

從我們的病例對(duì)照研究分析結(jié)果看,攜帶HO-1 L等位基因食管鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于對(duì)照組，差別是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。在這種本次對(duì)照研究中，我們發(fā)現(xiàn)了HO-1啟動(dòng)子GT重復(fù)長(zhǎng)度之間與食管鱗狀上皮癌的關(guān)系，尤其是GT重復(fù)大于31增加了患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)，這表明，較短的GT重復(fù)等位基因可能對(duì)食管癌有保護(hù)作用。

消化道疾病中，HO-1的水平增加，并發(fā)揮其對(duì)消化道的積極作用，主要是抗炎抗氧化等細(xì)胞保護(hù)作用[2]。血紅素在HO-1的作用下，降解為一氧化碳(CO)、膽綠素和鐵，膽綠素隨后被還原為膽紅素。HO-1不僅在體內(nèi)起到維持血紅素水平穩(wěn)定的作用，HO-1酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物在人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。膽紅素和膽綠素在一定濃度下是內(nèi)源性強(qiáng)抗氧化劑 具有抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞免受損傷及增強(qiáng)維生素C和維生素E抗氧化能力等作用。除此之外，膽紅素也被報(bào)道具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)的作用。許多研究證實(shí)膽紅素/膽綠素在許多病理?xiàng)l件下具有強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)作用[4]。根據(jù)亞洲人的基因特點(diǎn)，HO-1基因啟動(dòng)子序列(GT)n 重復(fù)次數(shù)值為10～39，22、29、33分別為其中的三個(gè)重復(fù)高峰，并且該研究還劃分了3個(gè)等位基因：S型位點(diǎn)n≤25; M型位點(diǎn)26～30;L型位點(diǎn)n≥31[5]。本研究發(fā)現(xiàn)L等位基因的頻率在食管癌組為26.9%明顯高于對(duì)照組14.2%，說明攜帶HO-1 L等位基因食管鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于對(duì)照組，相反較短的GT重復(fù)等位基因可能對(duì)食管癌有保護(hù)作用。

以往的研究表明，雖然HO-1啟動(dòng)子多態(tài)性多態(tài)性可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄但對(duì)腫瘤的進(jìn)展沒有影響，它可能排除HO-1的作用多態(tài)性作為腫瘤傳播的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。本研究證實(shí)了HO-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的(GT)n長(zhǎng)度重復(fù)多態(tài)性很可能是食管癌的易感基因，當(dāng)然，要證實(shí)該結(jié)論還有待于提高樣本量來進(jìn)一步研究。

總的來說，我們的線索表明，長(zhǎng)GT重復(fù)等位基因HO-1啟動(dòng)子和食管癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果還表明，較短的GT重復(fù)HO-1啟動(dòng)子等位基因可能在食管癌中的保護(hù)作用。

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3 劉智賢.HO-1啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與高血壓和冠心病的相關(guān)性研究.天津醫(yī)科大學(xué).2008.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.009

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20120447)

050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院(王獻(xiàn)偉、王愛玲、李延峰)；河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所(黃金娜、解俊霞)

R 735.1

A

1002-7386(2014)05-0668-03

2013-12-11)