，,

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

中藥麥冬為百合科多年生草本植物麥冬(Ophiopogonisjaponicus)的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心的功效，在臨床上應(yīng)用廣泛.我國藥典規(guī)定藥用麥冬主要品種包括湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬.其中，浙麥冬和川麥冬同屬于百合科沿階草屬，湖北麥冬則屬于百合科山麥冬屬.湖北麥冬主產(chǎn)于湖北襄樊，由于生長周期短，產(chǎn)量高，成為了麥冬的主流品種.川麥冬主產(chǎn)于綿陽三臺，與湖北麥冬并列為國家地理標(biāo)志性產(chǎn)品.浙麥冬又稱杭麥冬、筧麥冬，屬“浙八味”之一，是著名的道地藥材.由于湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬的外觀性狀及理化性質(zhì)都極為相似，很難用性狀鑒定，顯微鑒定和理化檢測等傳統(tǒng)鑒定方法將三者區(qū)分開來.

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于中藥鑒定，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)是在1990年Williams[1]和Welsh[2-3]領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組幾乎同時發(fā)展起來的一項(xiàng)新的DNA分子標(biāo)記技術(shù).它是建立在PCR基礎(chǔ)之上，可直接分析藥用植物DNA的多態(tài)性，并能篩選特有的DNA標(biāo)記.RAPD技術(shù)具有操作簡便，耗時短等優(yōu)點(diǎn)，在中藥材的分子鑒定研究領(lǐng)域中得到了廣泛的運(yùn)用[4-6].采用RAPD技術(shù)對湖北麥冬、川麥冬及浙麥冬三種藥用麥冬的基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，從而篩選出三種麥冬的特異性分子鑒定標(biāo)記，為建立一套高效、準(zhǔn)確的麥冬鑒定方法奠定基礎(chǔ)，對實(shí)現(xiàn)中藥材麥冬的分子鑒定具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥 材

中藥湖北麥冬植株購自湖北襄樊市歐廟鎮(zhèn)；中藥川麥冬植株購自著名麥冬生產(chǎn)基地四川省綿陽市三臺縣；中藥浙麥冬植株采自浙江寧波余姚和慈溪天元鎮(zhèn).以上樣品按照文獻(xiàn)[7-8]所述方法經(jīng)鑒定均為正品.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

植物基因組DNA快速抽提試劑盒和PCR相關(guān)試劑購自生工?生物工程(上海)有限公司.RAPD引物由生工?生物工程(上海)有限公司合成.實(shí)驗(yàn)使用的PCR擴(kuò)增儀MyCycle? Thermal Cycler，電泳儀Power PacTMBasic，凝膠成像系統(tǒng)Molecular Imager? Gel DocTMXR+Imaging System，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥冬基因組DNA的提取

稱取100 mg麥冬植株的新鮮嫩葉，剪碎放入研缽中，倒入液氮快速研磨成粉末，將粉末移入1.5 mL離心管中依次加入400 μL Buffer PCL Solution，8 μL β-巰基乙醇,震蕩混勻.65 ℃水浴45 min至細(xì)胞完全裂解，加入20 μL RNase A放置5 min，然后加入200 μL Buffer PP Solution，充分顛倒混勻后-20 ℃靜置5 min，室溫10 000 r/min離心5 min，將上清液移到新的1.5 mL離心管中；加入等體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，顛倒混勻置于4 ℃過夜，10 000 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇漂洗，10 000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)此步驟一次；開蓋倒置10 min至殘留的乙醇完全揮發(fā).提取獲得的基因組DNA用80 μL TE Buffer溶解，于-20 ℃儲存?zhèn)溆?

1.2.2 麥冬基因組DNA的質(zhì)量檢測

電泳法檢測麥冬基因組DNA的質(zhì)量：制備1%的瓊脂糖凝膠，樣品與上樣液混合后加入加樣孔中，在電壓75 V的條件下電泳50 min，膠板經(jīng)0.5 μg/mL溴化乙錠溶液染色后，移至凝膠成像系統(tǒng)，在紫外環(huán)境下觀察，檢測結(jié)果拍照留存.分光光度法檢測麥冬基因組DNA的質(zhì)量：將湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬基因組DNA進(jìn)行適量稀釋，以TE溶液為空白對照，測定各麥冬樣品的OD260值和OD280值，計(jì)算OD260/OD280值以評估基因組DNA的純度.根據(jù)公式DNA質(zhì)量濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×50，可計(jì)算出各樣品的DNA質(zhì)量濃度.

1.2.3 RAPD引物的合成

根據(jù)引物中GC百分比(%)較高，無發(fā)卡結(jié)構(gòu)的原則，從RAPD引物庫中選取了40條引物，均由10個堿基組成，送至上海生工生物工程有限公司合成.RAPD引物序列見表1.

表1 RAPD引物序列

1.2.4 RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化

RAPD反應(yīng)的初始體系為：2 μL 10×PCR buffer(without MgCl2)，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)，1 μL RAPD引物(20 μmol/L)，1 μL麥冬基因組DNA模板，補(bǔ) ddH2O至反應(yīng)液總體積為20 μL.初始RAPD擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后每個循環(huán)：94 ℃變性15 s，36 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對RAPD擴(kuò)增的研究經(jīng)驗(yàn)[9]，模板DNA濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶以及退火溫度對RAPD擴(kuò)增起到關(guān)鍵性作用.為了獲得RAPD擴(kuò)增的最佳效果，本實(shí)驗(yàn)依次對模板DNA濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶以及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)見表2.在優(yōu)化過程中，每次只調(diào)節(jié)一個單因素的量，其他因素維持在初始體系的濃度，在確立了最佳模板DNA濃度、引物濃度和Taq DNA聚合酶后再對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，完善擴(kuò)增程序，得出最佳的RAPD反應(yīng)體系，從而確保RAPD擴(kuò)增的穩(wěn)定性.

表2 RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的影響因素

1.2.5 麥冬分子鑒定標(biāo)記的篩選

以湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬基因組DNA為模板，逐一以40條隨機(jī)引物為擴(kuò)增引物，根據(jù)優(yōu)化后的RAPD最佳反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增.RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠板經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并照相留存.

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬基因組DNA的提取和質(zhì)量分析

三種麥冬基因組DNA的提取結(jié)果(圖1)顯示各麥冬基因組DNA大小在23 kb左右，DNA條帶清晰明亮，無彌散現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔內(nèi)無殘留，說明提取到的三種麥冬基因組DNA完整無降解，蛋白質(zhì)及多糖類雜質(zhì)較少，質(zhì)量較好，濃度較高.根據(jù)圖1中條帶的亮度，確定三種麥冬基因組DNA紫外分光光度法檢測的稀釋倍數(shù).稀釋的樣品在紫外分光光度計(jì)上檢測后的結(jié)果見表3，三種麥冬基因組DNA的OD260/OD280比值在1.804～1.907之間，DNA濃度介于351～736 μg/mL.紫外分光光度計(jì)檢測的數(shù)據(jù)亦表明三種麥冬基因組DNA的純度和濃度均較高，蛋白質(zhì)雜質(zhì)較少.

M—DNA分子量Marker；1—湖北麥冬新鮮嫩葉DNA提取物；2—川麥冬新鮮嫩葉DNA提取物；3—浙麥冬新鮮嫩葉DNA提取物

表3 麥冬基因組DNA的紫外檢測結(jié)果

高質(zhì)量的基因組DNA作為RAPD反應(yīng)的模板，是篩選分子鑒定標(biāo)記的關(guān)鍵.其中DNA的來源組織很重要，從新鮮嫩葉中提取DNA可以充分保證DNA的質(zhì)量.由于嫩葉組織中的細(xì)胞生長旺盛，DNA分裂快，DNA含量就高；并且由于是新生組織，次級代謝產(chǎn)物如蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)的含量都會是最低的.本實(shí)驗(yàn)以新鮮嫩葉為提取組織，提取到了高質(zhì)量的DNA，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行.

2.2 RAPD最佳反應(yīng)體系的建立

本實(shí)驗(yàn)室在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以浙麥冬基因組DNA為模板，S430為引物的RAPD圖譜條帶較豐富且清晰，因此以此反應(yīng)為研究對象進(jìn)行RAPD優(yōu)化實(shí)驗(yàn).優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，3，根據(jù)圖示結(jié)果選擇最佳的反應(yīng)條件.圖2(a)結(jié)果顯示：當(dāng)模板DNA濃度低于1.0 μL時，無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；高于1.0 μL時，擴(kuò)增條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，因此設(shè)定1.0 μL為最佳DNA模板量.圖2(b)結(jié)果顯示：當(dāng)引物濃度高于0.7 μmol/L時，擴(kuò)增條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象；當(dāng)引物濃度低于0.3 μmol/L時，無擴(kuò)增條帶或者條帶不清晰，因此設(shè)定0.5 μmol/L為最佳引物濃度.圖3(a)結(jié)果顯示：當(dāng)Taq DNA聚合酶低于1.0 U時，無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；高于2.0 U時，擴(kuò)增條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，因此設(shè)定1.5 U為最佳Taq DNA聚合酶.圖3(b)結(jié)果顯示：退火溫度為40 ℃時，擴(kuò)增條帶數(shù)目多且清晰，因此設(shè)定用40 ℃為最佳退火溫度.

M—DNA分子量Marker；1—5模板DNA體積0.5，0.8，1.0，1.2，1.4 μL;6—10引物濃度1.0，0.7，0.5，0.3，0.1 μmol/L

M—DNA分子量Marker；1—5 Taq DNA聚合酶 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U;6—10退火溫度34，36，38，40，42 ℃

通過對影響RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的RAPD反應(yīng)體系為：2 μL 10×PCR buffer(without MgCl2)，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.3 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)，0.5 μL RAPD引物(20 μmol/L)，1 μL麥冬基因組DNA模板，補(bǔ)ddH2O至反應(yīng)液總體積為20 μL.最佳的RAPD擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，然后每個循環(huán)：94 ℃變性15 s，40 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.

RAPD具有耗時短、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但也存在局限性，體現(xiàn)在使用隨機(jī)引物，以及退火溫度低引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差.通過對RAPD條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠使RAPD在本實(shí)驗(yàn)室的操作環(huán)境下保持最高程度的穩(wěn)定性，以利于麥冬分子鑒定標(biāo)記的篩選和回收.

2.3 麥冬分子鑒定標(biāo)記的篩選

以湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬基因組DNA為模板，逐一使用40條隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，進(jìn)行三種麥冬分子鑒定標(biāo)記的篩選.通過對40條引物結(jié)合下的40份RAPD擴(kuò)增圖譜的分析，共篩選到了6條分子鑒定標(biāo)記(圖4).這8條分子鑒定標(biāo)記分子量大小適宜，均在500～2 000堿基之間，條帶明亮清晰，利于回收.圖4(a)是引物S86結(jié)合下的RAPD結(jié)果，箭頭1所指的條帶是浙麥冬分子鑒定標(biāo)記；箭頭2所指的條帶是湖北麥冬分子鑒定標(biāo)記.圖4(b)是引物S65結(jié)合下的RAPD結(jié)果，箭頭1所指的條帶是湖北麥冬分子鑒定標(biāo)記；箭頭2所指的條帶是川麥冬分子鑒定標(biāo)記.圖4(c)是引物S64結(jié)合下的RAPD結(jié)果，箭頭1和2所指的條帶均為湖北麥冬分子鑒定標(biāo)記.圖4(d)是引物S22結(jié)合下的RAPD結(jié)果，箭頭1所指的條帶為浙麥冬分子鑒定標(biāo)記.圖4(e)是引物S20結(jié)合下的RAPD結(jié)果，箭頭1所指的條帶為川麥冬分子鑒定標(biāo)記.4條湖北麥冬標(biāo)記代表不同的基因序列，由于回收分子標(biāo)記過程中DNA會損失，分子標(biāo)記的回收和克隆是否成功存在一定的不可預(yù)計(jì)性，因此，收獲的分子鑒定標(biāo)記越多越好.從圖4可以看出：每個分子鑒定標(biāo)記只在一種麥冬中出現(xiàn)，而其他品種都不會出現(xiàn)，回收這些分子鑒定標(biāo)記，并進(jìn)行測序就可以獲得分子鑒定標(biāo)記的序列，這些序列具有特異性，可以根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)三種麥冬的特異性PCR鑒定.

對3種麥冬分子鑒定標(biāo)記的篩選發(fā)現(xiàn)湖北麥冬分子鑒定標(biāo)記數(shù)目較多，收獲的8條分子鑒定標(biāo)記中湖北麥冬占到了4條，浙麥冬和川麥冬各占2條.這說明湖北麥冬的基因組成與川麥冬和浙麥冬的差異顯著，川麥冬和浙麥冬的基因構(gòu)成則較為相似.從物種親緣性分析，浙麥冬和川麥冬是同屬于沿階草屬的，而湖北麥冬則屬于山麥冬屬.所以，分子鑒定標(biāo)記篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也間接體現(xiàn)了3個麥冬品種親緣性的遠(yuǎn)近.目前，篩選獲得的8條分子鑒定標(biāo)記的回收、克隆、測序工作正在進(jìn)行中.

3 結(jié) 論

RAPD技術(shù)具有操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種常用的中藥分子鑒定技術(shù)，但由于該技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性差，應(yīng)用受到了很大的制約.本實(shí)驗(yàn)從麥冬嫩芽組織中提取到了高質(zhì)量的基因組DNA，并對RAPD反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最大程度確保了RAPD擴(kuò)增的穩(wěn)定性.通過對湖北麥冬、川麥冬和浙麥冬3個品種麥冬基因組DNA的RAPD分析，篩選獲得了8條麥冬分子鑒定標(biāo)記，其中川麥冬和浙麥冬各2條，湖北麥冬4條.將這些標(biāo)志著麥冬特異性序列的分子標(biāo)記進(jìn)行回收、克隆和測序，可以根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，實(shí)現(xiàn)三種麥冬的特異性PCR鑒定，這種鑒定方法準(zhǔn)確，靈敏，重復(fù)性好，適用性廣，具有良好的應(yīng)用前景.

M—DNA分子量Marker；1—川麥冬基因組DNA模板；2—湖北麥冬基因組DNA模板；3—浙麥冬基因組DNA模板

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