邱大鵬 韓風(fēng) 賀濤

肝細(xì)胞癌（HCC）是臨床常見惡性腫瘤，疾病進(jìn)展快，病情危重，侵襲性較強(qiáng)，預(yù)后較差，患者生活質(zhì)量受到明顯下降。近年來我國發(fā)病率明顯升高，肝細(xì)胞癌由多種方式因素引起，乙型肝炎病毒感染、肝硬變等均是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要原因。甲胎蛋白（AFP）作為診斷HCC的重要指標(biāo)，在臨床廣泛使用，然而對(duì)肝癌的特異性及敏感性均較低，因此探討更為有效的診斷方法，研究更為敏感、特異的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高診斷率，提高患者生存率有著重要作用[1]。臨床研究顯示，多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)效果明顯優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，特異性及敏感性更高，筆者對(duì)2005年4-7月收治的82例HCC患者進(jìn)行AFPmRNA聯(lián)合甲胎蛋白（AFP）異質(zhì)體AFP-L3）檢測(cè)，對(duì)其與HCC的診斷及預(yù)后關(guān)系進(jìn)行探討，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年4-7月本院部分住院患者血清資料庫中的112份血清標(biāo)本，其中男76例，女36例，年齡30～73歲；平均（45.62±6.2）歲；肝臟良性病變19例（其中2例炎性假瘤，3例血管平滑肌脂肪瘤，2例灶性結(jié)節(jié)性增生，12例血管瘤），肝硬化合并門脈高壓（LC）11例，HCC82例。患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷確診，為了排除其他因素對(duì)肝癌預(yù)后分析的影響，將HCC患者的入選標(biāo)準(zhǔn)定為：?jiǎn)伟l(fā)腫瘤<5 cm，或多發(fā)腫瘤直徑之和<5 cm，無癌栓，肝功能在Child B級(jí)以上。

1.2 試劑與儀器 采用武漢中美科技有限公司生產(chǎn)的USCNLIFE SCIENCE人小扁豆素結(jié)合型甲胎蛋白/甲胎蛋白異質(zhì)體3（AFP-L3）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，鄭州久是生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的探針及引物，BIO-RAD M680酶標(biāo)儀，HH-42三用恒溫水箱，Himac CR 21G低溫高速離心機(jī)，Biometra TGRADIENT梯度PCR儀，MS1 Minishkaer IKA 渦旋混合器，LightCycler 1.5 ROCHE熒光定量PCR儀；寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的AFP酶連試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 分別在患者入院前、后1個(gè)月晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5 mL，迅速分離血清，血細(xì)胞備用，放置在-80 ℃環(huán)境內(nèi)備測(cè)，在測(cè)定前將標(biāo)本取出，自然復(fù)融后對(duì)血清中AFP-L3、AFP水平進(jìn)行檢測(cè)。采用人小扁豆素結(jié)合型甲胎蛋白/甲胎蛋白異質(zhì)體3（AFP-L3）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定AFP、AFP-L3的含量，并計(jì)算AFP-L3占AFP總量的百分比，以AFP-L3大于15%作為AFP-L3異常升高標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 熒光定量RT-PCR 用常規(guī)密度梯度離心法分離外周血有核細(xì)胞?？俁NA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，于紫外分光光度計(jì)上定量，用Primescript試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。引物及探針為上游引物：5'-GTAAACCCTGGTCTTGGCC-3'；下游引物：下游引物：5'-TCAGAGAATGCAGGAGGGAC-3'，擴(kuò)增最終片段長(zhǎng)282 bp；熒光 探 針：5'-TTCATATGCCAACAGGAGGCCATGC-3'。 內(nèi) 參為GADPH，上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，產(chǎn)物為450 bp。第 1輪 PCR，反應(yīng)體系為 50 μL。取 cDNA 5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，第1輪PCR上、下游外引物各7.5 pmol，Taq DNA聚合酶2.0 U，加滅菌水至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃5 min 預(yù)變性；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min延伸。第2輪PCR取第1輪PCR產(chǎn)物作模板，加入7.5 pmol上下游內(nèi)引物，余反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同前。同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增。最后繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品和內(nèi)參的Ct值，兩者相比即得相對(duì)量的表達(dá)。每次RT-PCR實(shí)驗(yàn)均以分泌AFP的肝癌細(xì)胞系HepG2為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照則以水取代cDNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前不同腫瘤指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 AFP-L3聯(lián)合AFPmRNA檢測(cè)陽性率為64.3%，明顯高于AFP、AFP-mRNA單獨(dú)檢測(cè)的陽性率（50.9%、40.2%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與AFP-L3單獨(dú)檢測(cè)陽性率相比，雖聯(lián)合檢測(cè)陽性率升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 術(shù)前不同腫瘤指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 例（%）

2.2 AFP-L3、AFPmRNA術(shù)后單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)陽性患者生存率 術(shù)前、術(shù)后聯(lián)合檢測(cè)AFP-L3和AFPmRNA均陽性的患者術(shù)后3年生存率較低。見圖1、圖2。

3 討論

AFP是臨床診斷肝細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)使用較長(zhǎng)時(shí)間，然而其特異性及敏感性較低[2-3]，臨床診斷仍然存在較大的誤診漏診率，新的符合需要的標(biāo)志物又尚未發(fā)現(xiàn)，為了提高對(duì)肝癌診斷，聯(lián)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物就成為新的思路。

1970年，有學(xué)者首次采用淀粉凝膠電泳方法將AFP異質(zhì)體由人體內(nèi)分離[4]，AFP-L3則是肝癌細(xì)胞特異合成，與學(xué)AFP的濃度并無直接明顯關(guān)系，隨著臨床研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，在HCC的臨床診斷、判定治療效果及預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面均有顯著效果，且相較AFP具有更高的敏感性。

圖1 術(shù)后AFP-L3陽性與AFA-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測(cè)陽性患者生

圖2 術(shù)后AFPmRNA陽性與AFP-L3、AFPmRNA聯(lián)合檢測(cè)陽性患者生存曲線比較

AFP-L3作為AFP的異質(zhì)體提高了肝癌診斷的特異性和敏感性，但它不能直接證實(shí)肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。1994年Matsumua等[2]首先運(yùn)用巢式RT-PCR法檢測(cè)出AFP mRNA存在于肝外轉(zhuǎn)移的HCC患者外周血中，AFPmRNA是否能作為HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的研究成為熱點(diǎn)。正常人體的訓(xùn)循環(huán)細(xì)胞中未出現(xiàn)AFPmRNA表達(dá)，而脫落進(jìn)入血循環(huán)的正常肝細(xì)胞則失去了對(duì)AFPmRNA的表達(dá)能力，當(dāng)腫瘤細(xì)胞破碎后，需將中大量的RNA酶會(huì)將mRNA迅速講解，本次研究中，筆者檢測(cè)出的AFPmRNA即是從癌變病灶脫落入血的完整肝癌細(xì)胞，因此可作為肝癌細(xì)胞血液播散標(biāo)志，提示即使臨床上未見有轉(zhuǎn)移灶，但外周血中已存在循環(huán)的癌細(xì)胞，繼而易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[5-6]。雖然有一部分學(xué)者的研究并不支持這種觀點(diǎn)[7-8]，但從理論上看及大部分的研究認(rèn)為，AFPmRNA作為肝癌細(xì)胞血液播散標(biāo)志物是可行的。

通過手術(shù)治療能夠有效抑制肝癌病情，促進(jìn)患者康復(fù)，術(shù)前患者血循環(huán)內(nèi)可能已經(jīng)存在少量的癌細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體免疫功能受到破壞時(shí)，血內(nèi)癌細(xì)胞繁殖并擴(kuò)散，導(dǎo)致肝癌術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)率，因此在臨床檢測(cè)中，通過觀察血液循環(huán)中是否出現(xiàn)癌細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察癌細(xì)胞變化，能夠有效的指導(dǎo)臨床治療及對(duì)預(yù)后狀況進(jìn)行判斷評(píng)估[9-11]。

本次研究結(jié)果顯示，AFPmRNA聯(lián)合AFP-L3檢測(cè)陽性率為64.3%，相較AFP（59.8%）、AFP-mRNA（40.2%）單獨(dú)檢測(cè)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與AFPL3單獨(dú)檢測(cè)陽性率相較，雖聯(lián)合檢測(cè)陽性率明顯升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能是筆者試驗(yàn)收納的樣本量過小所致，需以后作大批量試驗(yàn)進(jìn)一步研究。術(shù)后聯(lián)合檢測(cè)AFP-L3和AFPmRNA的水平與肝癌預(yù)后有關(guān)，兩者皆為陽性的病例復(fù)發(fā)率較高；3年生存率下降，兩者皆陽性者的生存率（32.7%）與單獨(dú)陽性者得生存率（49.2%）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示AFPmRNA，AFP-L3對(duì)診斷肝細(xì)胞癌的殘留復(fù)發(fā)更加敏感。由于外周血AFPmRNA水平與血AFP濃度之間并無明確直接關(guān)聯(lián)，因此在HCC的診斷中具有較高的靈敏性及特異性，陽性檢出率較高，兩者之間可進(jìn)行互補(bǔ)，同時(shí)可對(duì)AFP濃度無法準(zhǔn)確反映HCC是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的缺陷進(jìn)行彌補(bǔ)，從而為預(yù)后做出評(píng)估，還可早期診斷HCC，尤其對(duì)AFP陰性肝癌的診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究表明，AFP-L3聯(lián)合AFPmRNA檢測(cè)能夠及時(shí)準(zhǔn)確診斷HCC，同時(shí)可對(duì)治療效果判斷及復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)，能夠?yàn)榕R床治療方案的制定進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo)，具有顯著臨床意義。

[1]Yoshida S，Kurokohchi K，Arima K，et al.Clinical significance of Lens culinaris agglutinin-reactive fraction of serum alpha-fetoprotein in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol，2002，20（2）：305-309.

[2]Matsumura M，Niwa Y，Kato N，et al.Detection of a-fetoprotein mRNA .an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma， in the circulation： a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，1994，20（11）：1418-1425.

[3]Hillaire S，Barbs V，Boucher E，et al.Albumin messenger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterol，1994，106（1）：239.

[4]Lemoine A，LeBricon T，Salvucci M，et al.Prospective evaluation of circulating hepatocytes by alpha-fetoprotein mRNA in humans during liver surgery[J].Ann Surg，1997，226（15）：43-50.

[5]趙鴻，陳孝平，趙西平，等.AFP-mRNA作為血中肝癌細(xì)胞的標(biāo)志缺乏特異性[J].中華肝膽外科雜志，2002，8（11）：683-686.

[6]Cillo U，Navaglia F，Vitale A，et al.Clinical significance of alphafetoprotein mRNA in blood of patients with hepatocellular carcinoma[J].Clin Chim Acta，2004 ，347（1-2）：129-138.

[7]趙冬梅，韓福剛.肝細(xì)胞癌TACE術(shù)后療效的影像學(xué)評(píng)價(jià)[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，20（15）：321-322.

[8]于麗波.肝局灶性結(jié)節(jié)性增生與肝細(xì)胞癌MRI特征對(duì)比分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，31（14）：18-20.

[9]張慶輝，劉鵬程.C-arm CT在肝腫瘤TACE治療中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，15（19）：119-121.

[10]吳鋒，李元.64排螺旋CT三維血管成像在肝細(xì)胞癌診治中的應(yīng)用[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，21（23）：201-202.

[11]苑進(jìn)凱，祝葆華，魏娟，等.TIMP-3基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其意義[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，31（3）：249-250.