於紹龍，劉丹平

(1.遼寧醫(yī)學院;2.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)-2 是轉化生長因(trans-forming growth factor，TGF)-β超家族的生長因子，為促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一。在骨形成過程中，BMP-2 作為啟動調節(jié)因子促進新骨形成，并且在出生后，BMP-2 也參與骨骼動態(tài)平衡的維持。骨組織生長、發(fā)育、代謝和衰老表現(xiàn)為骨量增加或減少，在組織學上則以骨生成和骨重建方式進行，表現(xiàn)為骨組織細胞分化、增殖、凋亡。其中涉及的多條信號通路中BMP-2/Smads/Runx2 信號通路對于骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞及骨細胞外基質合成、分泌顯得尤為重要。

1 BMP-2 及其受體

BMPs 是TGF-β 超家族中的成員之一，為廣泛存在于骨基質中的酸性糖蛋白，目前已有20 余種成員，是較強的成骨因子［1］。其中BMP-2 是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一，其在體內以自分泌和旁分泌的形式誘導骨、軟骨及骨相關結締組織的形成［2］。

BMP-2 含有兩種受體，分別為I 型受體(bone morphogenetic protein receptor I，BMPR-I)和II 型受體(bone morphogenetic protein receptor II，BMPR-II)［3］。兩種受體是跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在胞內區(qū)具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，該受體以二聚體行使功能。BMPR-I 為單次跨膜的糖蛋白受體，在BMPR-I 的胞漿區(qū)蛋白激酶結構N 段和細胞之間，存在一個富含絲氨酸(Serine，Ser)和甘氨酸(Glycine，Gly)的結構域，稱為GS 結構域，有若干的磷酸化位點，GS 結構域中有一段保守的Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 序列，稱為GS 序列，為BMPR-I 所特有，可以被BMPR-II 激酶磷酸化，從而使BMPR-I 型受體磷酸化，向胞內傳遞胞外信號［4］。BMPR-II 與BMPR-I結構類似，但與BMPR-I 的不同點為:分子量稍大;細胞膜外區(qū)較BMPR-I 長;無GS 結構域;具有不依賴配體的組成性激酶活性，但可以與BMP-2 結合［5］。BMP-2 與細胞表面BMPR-I 和BMPR-II 結合而激活，通過激活下游Smads 信號調節(jié)成骨基因轉錄而發(fā)揮其成骨作用。

2 Smads

Smads 蛋白家族是近年發(fā)現(xiàn)的細胞內信號傳導蛋白，直接參與TGF-β 超家族成員的信號傳導。目前發(fā)現(xiàn)9 個亞型，即Smad1～9。Smads 家族成員結構類似，由Mad 以及Sma 兩個相關等位基因編碼?；窘Y構主要由3 個結構域組成:保守氨基端(N 段)MH1 區(qū)，為Mad 類似物1，主要與DNA 結合，但在Smads 未激活之前，它也有抑制MH2轉錄激活的作用;羧基端(C 段)MH2 區(qū)，為Mad 類似物2，它參與Smads 與受體的結合以及Smads 之間的聚合體的形成，MH2 區(qū)也有抑制MH1 區(qū)與DNA 結合的作用;中央鏈接區(qū)，為富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)，可將MH2 區(qū)及MH1 區(qū)鏈接成一個完整的分子。該連接區(qū)內有多個磷酸化位點，被磷酸化激活后可以抑制Smads 蛋白的核轉移，是Smads蛋白的負調控區(qū)域［6］。

根據(jù)結構以及在信號轉導中的作用將Smads 蛋白分為3類:(1)受體調節(jié)型Smad (Receptor activated Smad，R-Smad)，包 括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9，其中Smad1、Smad5、Smad8 可調節(jié)BMP-2 信號轉導。R-Smad 蛋白C 端功能域末端含有絲氨酸-絲氨酸-任意氨基酸-絲氨酸(Ser-Ser-X-Ser，SSXS)磷酸化位點，可與BMPR-I 直接作用并被磷酸化，磷酸化的R-Smad 與Co-Smad 形成復合物后可轉移至細胞核內，調節(jié)靶基因對BMP-2 信號的表達;(2)共同介質型Smad(Common Smad，Co-Smad)，哺乳動物類只有Smad4，被磷酸化后與R-Smad 形成雜聚體，然后轉運至細胞核調節(jié)靶基因的轉錄。它的C 端功能域沒有磷酸化位點，不能與BMPR-1 相互作用，也不能被磷酸化，但它可以與Smad家族中的其它成員相互作用并形成穩(wěn)定的異源三聚體。這種三聚體的形成是BMP-2 信號轉導所必須，Smad4 缺陷的細胞不再對BMP-2 信號產生應答，而轉染野生型Smad4可以重建其表達［7］;(3)抑制性Smad (Inhibitory Smad，I-Smad)，包括Smad6，Smad7，對信號通路發(fā)揮負調控作用。它們在結構上和其它的Smad 成員有很大的不同，C 端功能域缺乏磷酸化位點，沒有保守的MH1 功能域，而只在MH2 功能域與其它的Smad 具有較大的同源性。I-Smad 與R-Smad 競爭性與BMPR-I 結合，干擾R-Smad 與BMPR-I 結合以及磷酸化，從而抑制信號轉導，在BMP-2 信號通路中發(fā)揮負調控作用。經典的Smads 通路是R-Smads 激活后與Co-Smad 形成復合體，共同轉移至細胞核內調節(jié)靶基因轉錄［8］。

3 Runx2

Runxs 是新發(fā)現(xiàn)的一類調控間充質干細胞向成骨方向分化的特異性轉錄因子，它們的分子結構中均含有一個由128個氨基酸組成的DNA 結合區(qū)，該結合區(qū)與果蠅屬的分節(jié)基因Runt 同源，因此而被稱為Runt 結構域。Runxs 包含三個亞型，Runx1、Runx2 和Runx3。Runx1 是紅細胞形成所必需的蛋白，人類白血病中常見多種染色體易位于Runx1 基因，其突變可導致急性骨髓細胞性白血病。Runx3 則參與神經元形成、胸腺激素生成以及腫瘤抑制作用，它的突變與胃癌發(fā)生相關。Runx2 又稱核結合因子(core-binding factor subunit alpha-1，Cbfα1)，為重要的成骨細胞分化轉錄因子。Runx2 參與調控成骨細胞分化進程中細胞外基質蛋白的基因表達，同時通過調節(jié)軟骨、成骨細胞的分化完成對骨生成的控制，對成骨細胞的成熟、穩(wěn)定起了重要的作用［9］。

Runx2 存存在3 個轉錄激活域(AD)、1 個抑制區(qū)域(RD)和1 個短的Myc 相關核定位信號(nuclear localization signal，NLS)。它的3 個激活結構域(AD1、AD2、AD3)中主要的激活結構域為AD3，AD1、AD2 的結構域使Runx2具有強大的轉錄能力，但是不能自主活化轉錄。Runx2 能通過C 末端區(qū)域與Smads 蛋白相互作用形成共調節(jié)子，激活或者阻遏表達。Runx2 的C 末端區(qū)域含有核基質定位信號(nuclear matrix targeting signal NMTS)可將Runx2 定位在核內區(qū)域調控骨特異性基因轉錄，此信號序列與Smads 相互作用的區(qū)域相互重疊，一旦此區(qū)域發(fā)生突變成骨細胞分化不能正常進行骨發(fā)育出現(xiàn)缺陷［10］。

Runx2 的表達受到參與成骨細胞分化的多種生長因子和激素的調控，BMPs 是成骨細胞分化和骨形成最有效的誘導因子，可以通過Smads 途徑上調Runx2 的表達。過氧化物酶體增殖因子激活受體γ2 抑制其表達和成骨細胞分化，腫瘤壞死因子α、1-25-(OH)2D3、糖皮質激素可能抑制或降低Runx2 的表達。Runx2 亦可通過自身啟動子的負調控機制自動調控。Runx2 的表達及功能在鼠的Runx2 啟動子區(qū)至少有3 個Runx2 識別位點，強制表達Runx2 蛋白可以下調Runx2 啟動子活性。一個Runx2 位點就足以抑制轉錄，這種自我調控嚴格控制Runx2 的表達從而調控骨相關基因的表達和成骨分化［11］。

4 BMP-2/Smads/Runx2 信號通路

BMP-2 通過結合靶細胞表面2 種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(BMPR-I，BMPR-II)

向胞內傳遞信號。BMP-2 與持續(xù)表現(xiàn)激酶活性的BMPR-II 結合后，BMPR-I 能夠特異性與此二聚體結合而發(fā)生自身磷酸化。BMPR-I 再通過磷酸化Smad1 或Smad5 使其活化，被激活的Smad1 或Smad5 結合Smad4 進入胞核，調節(jié)特定基因轉錄的功能。Smads 蛋白作為共調節(jié)子和Runx2 相互作用共同參與成骨細胞表型基因表達和分化。用外源的BMP-2 可以啟動信號通路激活Smads 復合物調節(jié)下游基因的表達，但是Smads 復合物對基因調節(jié)的特異性較低，下游基因的特異表達需要特異性轉錄因子Runx2的參與［12］。Runx2 可以和骨鈣蛋白啟動子區(qū)的成骨細胞特異性順式作用元件2 (Osteoblast-specific cis-acting element 2，OSE2)相結合刺激骨鈣蛋白的表達，在I 型膠原、骨涎蛋白及骨橋蛋白等成骨細胞相關基因的啟動子區(qū)都有OSE2 樣元件，Runx2 能與這些OSE2 樣元件結合激活這些基因表達［13］。

Runx2 能與Smads 蛋白共同調節(jié)成骨細胞膠原的表達，Runx2 可以直接結合到OSE2 上轉錄激活骨鈣蛋白基因的啟動子。而Smad1 和Smad5 自身不能結合到OSE2 上只有在Runx2 的幫助下才能結合到OSE2 上轉錄激活骨鈣蛋白啟動子。Runx2 通過其C 末端的核基質定位信號將Smads 定位在核內活躍轉錄位點，兩者形成復合物與核基質結合共同調控基因表達和細胞分化。該核基質定位信號對Runx2 在核內的精確定位及Runx2 依賴性分化基因的表達調控是必要的。Runx2 C 末端刪除純合小鼠因為成骨細胞成熟受阻而不能成骨，Smads 和Runx2 相互作用并增強Runx2 對靶基因的轉錄激活活性［14］。

5 相關調節(jié)因子

5.1 Smurf 1 Smurf 1 即泛素化調節(jié)因子1，屬于E3 泛素連接酶家族。它與BMP-2 信號蛋白Smad1、Smad5 及成骨特異性轉錄因子Runx2、BMPR-I 相互作用，調節(jié)這些蛋白質在蛋白酶體中被降解。Chen［15］等研究發(fā)現(xiàn)，Smurf1 與BMP-2 激活的Smad1、Smad5 相互作用并調節(jié)成骨細胞特異性轉錄因子Runx2 降解，闡明Smurf1 在體內成骨分化和骨形成中具有特定作用。Xing 等［16］實驗發(fā)現(xiàn)，Smad6、Smurf1 和Runx2 均位于細胞核，Smad6 與Smurf1 的協(xié)同作用可下調Runx2 蛋白水平，為BMP-2/Smads/Runx2 信號通路的負性調節(jié)機制。

5.2 Menin Menin 即1 型多發(fā)性內分泌腺瘤腫瘤抑制基因產物。作為一種核蛋白，它在轉錄調節(jié)、基因組穩(wěn)定、細胞分裂和增殖方面發(fā)揮作用，可促進多能間充質干細胞分化為成骨細胞，抑制成骨細胞晚期分化。Menin 通過BMP-2/Smad1 (Smad5)/Runx2 級聯(lián)反應促進間充質干細胞分化為成骨細胞，Menin 與Smad3 共同增強BMP-2 誘導的Smad1/Smad5、Runx2 的轉錄活性［17］。

5.3 Cthrc1 Cthrc1 為膠原三股螺旋重復蛋白1，作為成骨細胞骨形成的正性調節(jié)可使骨量增加。經實驗證實Cthrc1作為成軟骨組細胞樣細胞BMP-2 的下游基因，在活體組織中表達［18］。對于無Cthrc1 鼠或者轉基因鼠獲得的骨髓細胞集落形成單位的體外研究表明其可以刺激骨組細胞分化和礦化，在無Cthrc1 鼠生長初期堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，I 型膠原和骨鈣素(Ostccalcin，OC)表達減少［19-20］。

成骨細胞的分化成熟及礦化是骨發(fā)生和骨折等愈合的基礎，該過程通過相應的信號傳導途徑來啟動骨特異性轉錄因子和生長因子的表達，進而促進成骨并完成骨修復功能。BMP-2 信號轉導通路在骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化和成骨細胞的分化成熟方面起著至關重要的作用。大量基礎實驗研究證實，BMP-2 信號通路參與成骨細胞分化以及骨細胞細胞外基質合成與分泌，促進骨形成，增加骨量。研究該通路蛋白和影響通路的相關因子可作為開發(fā)抗骨質疏松、骨腫瘤或促進骨愈合藥物的靶標，為臨床應用提供依據(jù)，同時也為藥物研究及分子機制提供依據(jù)。

［1］Obradovic Wagner D，Sieber C，Bhushan R，et al.BMPs:from bone to body morphogenetic proteins ［J］.Science signaling，2010，3 (107):mr1.

［2］Vlacic-Zischke J，Hamlet S M，F(xiàn)riis T，et al.The influence of surface microroughness and hydrophilicity of titanium on the upregulation of TGFβ/BMP signalling in osteoblasts ［J］.Biomaterials，2011，32 (3):665-671.

［3］Lin GL，Hankenson KD.Integration of BMP，Wnt，and notch signaling pathways in osteoblast differentiation ［J］.Journal of cellular biochemistry，2011，112 (12):3491-3501.

［4］Jang WG，Kim EJ，Lee KN，et al.AMP-activated protein kinase (AMPK)positively regulates osteoblast differentiation via induction of Dlx5-dependent Runx2 expression in MC3T3E1 cells［J］.Biochemical and biophysical research communications，2011，404 (4):1004-1009.

［5］Tang QQ，Lane MD.Adipogenesis:from stem cell to adipocyte［J］.Annual review of biochemistry，2012，81:715-736.

［6］Hellingman CA，Davidson ENB，Koevoet W，et al.Smad signaling determines chondrogenic differentiation of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells:inhibition of Smad1/5/8P prevents terminal differentiation and calcification ［J］.Tissue Engineering Part A，2011，17 (7-8):1157-1167.

［7］Liang W，Lin M，Li X，et al.Icariin promotes bone formation via the BMP-2/Smad4 signal transduction pathway in the hFOB 1.19 human osteoblastic cell line ［J］.International journal of molecular medicine，2012，30 (4):889.

［8］Nishimura R，Hata K，Matsubara T，et al.Regulation of bone and cartilage development by network between BMP signalling and transcription factors ［J］.Journal of biochemistry，2012，151(3):247-254.

［9］Komori T.Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2 ［J］.Cell and tissue research，2010，339 (1):189-195.

［10］Komori T.Regulation of osteoblast differentiation by runx2［M］//Osteoimmunology.Springer US，2010:43-49.

［11］Komori T.Signaling networks in RUNX2 ‐dependent bone development ［J］.Journal of cellular biochemistry，2011，112(3):750-755.

［12］Jun JH，Yoon WJ，Seo SB，et al.BMP2-activated Erk/MAP kinase stabilizes Runx2 by increasing p300 levels and histone acetyltransferase activity ［J］.Journal of biological chemistry，2010，285 (47):36410-36419.

［13］Liu TM，Lee EH.Transcriptional regulatory cascades in runx2-dependent bone development ［J］.Tissue Engineering Part B:Reviews，2012，19 (3):254-263.

［14］Pratap J，Lian JB，Stein GS.Metastatic bone disease:role of transcription factors and future targets ［J］.Bone，2011，48(1):30-36.

［15］Chen G，Deng C，Li YP，et al.TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation ［J］.International journal of biological sciences，2012，8 (2):272.

［16］Xing L，Zhang M，Chen D.Smurf control in bone cells ［J］.Journal of cellular biochemistry，2010，110 (3):554-563.

［17］Kaji H，Canaffand L，Hendy GN.Role of menin in bone development ［M］//SuperMEN1.Springer New York，2010:59-67.

［18］Takeshita S，F(xiàn)umoto T，Matsuoka K，et al.Osteoclast-secreted CTHRC1 in the coupling of bone resorption to formation［J］.The Journal of clinical investigation，2013，123 (9):3914.

［19］Matsuoka K，Park K，Ito M，et al.Osteoclast‐Derived Complement Component 3a Stimulates Osteoblast Differentiation［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2014.

［20］Larsen KH，F(xiàn)rederiksen CM，Burns JS，et al.Identifying a molecular phenotype for bone marrow stromal cells with in vivo bone‐ forming capacity ［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2010，25 (4):796-808.