路獻(xiàn)勇， 張 帥， 呂麗敏， 雒珺瑜， 王春義， 崔金杰

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000

自1990年國外首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得Cry1Ab、Cry1Ac轉(zhuǎn)基因棉花植株以來(Perlaketal.,1990)，編碼Cry1Ac蛋白的基因已成功應(yīng)用于植物基因工程，并培育出了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用于大規(guī)模生產(chǎn)。中國研究人員也于1993年將Cry1Ac基因?qū)氲街袊鳟a(chǎn)棉區(qū)的數(shù)個栽培品種中，獲得了第1代單價抗蟲棉(郭三堆等，1999)。目前中國主要以種植轉(zhuǎn)單價Bt基因的抗蟲棉花為主，由于轉(zhuǎn)入的Bt基因類型單一，長期種植容易導(dǎo)致棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner對Cry1Ac基因的抗性增加，因此，為了延緩靶標(biāo)害蟲對Cry1Ac蛋白的抗性，培育疊加基因的抗蟲棉花品種受到廣泛重視。目前，轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉已在美國、澳大利亞、墨西哥等國家商業(yè)化種植，我國也培育出了轉(zhuǎn)雙價基因Cry1Ac+Cry2Ab的抗蟲棉(雒珺瑜等，2011)。為了揭示不同Bt蛋白的抗蟲效果，本文研究了Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6種Bt蛋白對棉鈴蟲幼蟲室內(nèi)種群存活率、體重和生長發(fā)育的影響，期望為新一代轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的培育提供依據(jù)，為新型轉(zhuǎn)基因棉花材料的抗蟲性鑒定和安全評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試棉鈴蟲

室內(nèi)敏感品系：2005年6月采自河南省安陽縣白壁鎮(zhèn)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉田第2代，在室內(nèi)不用任何藥劑處理，連續(xù)用人工飼料飼養(yǎng)70代。

1.2 供試Bt蛋白

Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6種Bt蛋白均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所中?？妻r(nóng)公司(北京)提供。

1.3 棉鈴蟲人工飼料

采用卓樂姒等(1981)的棉鈴蟲人工飼料配方經(jīng)稍微改進(jìn)。人工飼料配方如下：黃豆粉200 g，玉米粉300 g，小麥粉300 g，抗壞血酸10 g，酵母粉80 g，甲醛10 mL，36%乙酸60 mL，苯甲酸鈉9 g，瓊脂35 g，水2000 mL。成蟲期飼喂10%的蜂蜜水。養(yǎng)蟲室每月用紫外燈消毒1次，棉鈴蟲蛹用甲醛消毒15 min，以防止棉鈴蟲遭受核角體病毒的侵染。

在配制飼料過程中，當(dāng)飼料內(nèi)的溫度降到55～60 ℃時，取不同濃度的Bt蛋白分別加到不同處理的人工飼料中，每個處理的飼料量為100 g；用攪棒迅速攪勻，待飼料凝固后放入4 ℃冰箱備用。使用前切成1 g左右的塊狀，分別放入24孔培養(yǎng)板中用于飼養(yǎng)棉鈴蟲幼蟲，培養(yǎng)板表面覆蓋白布以防止幼蟲逃逸。

1.4 生物測定方法

1.4.1 不同Bt蛋白對棉鈴蟲初孵幼蟲的毒力測定 測定包括預(yù)備試驗和正式試驗2個部分。預(yù)備試驗共設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度，將供試幼蟲的死亡率控制在10%～90%范圍內(nèi)；其中Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Ab的濃度梯度為1.0、0.5、0.1、0.01和0.001 μg·g-1；Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca的質(zhì)量濃度梯度為20.0、5.0、2.0、1.0和0.5 μg·g-1。正式試驗共設(shè)置7個濃度梯度，其中Cry1Ac、Cry1Ab和Cry2Ab的濃度梯度為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.001 μg·g-1；Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca的濃度梯度為20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625和0.3125 μg·g-1。均用5 mL的Na2CO3溶液作為對照。

毒力測定前先用pH 9.5的Na2CO3溶液對毒蛋白進(jìn)行稀釋，然后將稀釋后的Bt毒蛋白混入飼料中(Beegleetal.,1990)。測定時在飼料中接入孵化后1日齡幼蟲(24 h±2 h)，在溫度(27±1) ℃、濕度(75±5)%、光周期(光照/黑暗)14/10以及合適的光強(qiáng)條件下飼養(yǎng)。每處理24頭幼蟲，重復(fù)6次。飼養(yǎng)7 d后記錄幼蟲存活數(shù)，計算校正死亡率。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Probit回歸分析，計算LC50值(賈春生，2006)。

1.4.2 不同Bt蛋白對棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育的影響 配制飼料前用pH 9.5的Na2CO3溶液分別將6種蛋白稀釋成100 μg·mL-1，配制飼料時取稀釋好的Bt蛋白溶液5 mL混入100 g飼料，使其在飼料中的濃度為1.0 μg·g-1，對照僅混入5 mL的Na2CO3。

測定設(shè)初孵幼蟲、1齡幼蟲和2齡幼蟲3組試驗。每組試驗設(shè)6種Bt蛋白和對照共7個處理，每處理32頭幼蟲，重復(fù)3次。測定時在飼料中接入幼蟲，放置在與1.4.1相同的條件下飼養(yǎng)。初孵幼蟲和1齡幼蟲飼養(yǎng)7 d后，分別記錄幼蟲死亡率，并用電子天平(精確到0.00001 g)稱取所有活蟲體重，計算體重抑制率。

體重抑制率(%)=(對照組平均體重-處理后平均體重)/對照組平均體重×100。

2齡幼蟲飼養(yǎng)3、5、7和9 d后分別稱取幼蟲體重，每天記錄幼蟲發(fā)育天數(shù)、化蛹數(shù)、蛹重、蛹期天數(shù)和羽化數(shù)，直至羽化完成。試驗數(shù)據(jù)用SAS 8.1軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Bt蛋白對棉鈴蟲初孵幼蟲的毒力測定

由表1可知，不同Bt蛋白對棉鈴蟲的毒力效應(yīng)不同，用Bt蛋白連續(xù)飼喂7 d后的致死中濃度(LC50)依次為Cry1Ab>Cry1Ac>Cry2Ab>Cry2Aa>Cry1Ah。

表1 不同Bt蛋白處理的棉鈴蟲初孵幼蟲的致死中濃度(LC50)和線性回歸方程參數(shù)Table 1 Mean lethal concentrations (LC50)and probit regression line parameters of Bt proteins against the newly hatched larvae of cotton bollworm (H.armigera)

2.2 不同Bt蛋白對棉鈴蟲低齡幼蟲校正死亡率和體重抑制率的影響

棉鈴蟲初孵幼蟲和1齡幼蟲取食含不同Bt蛋白飼料7 d后，不同處理間的校正死亡率有極顯著差異(初孵幼蟲，df=5，F(xiàn)=341.81，P<0.0001；1齡幼蟲，df=5，F(xiàn)=329.02，P<0.0001)。不同處理間的體重抑制率也有極顯著差異(初孵幼蟲，df=5，F(xiàn)=337.50，P<0.0001；1齡幼蟲，df=5，F(xiàn)=57.84，P<0.0001)。Cry1Ac和Cry1Ab蛋白對棉鈴蟲初孵幼蟲的校正死亡率極顯著高于Cry2Ab蛋白，與Cry2Ab蛋白相比，Cry1Ah和Cry2Aa蛋白處理的棉鈴蟲初孵幼蟲的校正死亡率顯著降低，Cry1Ca處理下，初孵幼蟲死亡率極顯著低于另外5種蛋白。而對于1齡棉鈴蟲則略有不同，Cry1Ab蛋白顯著高于其余5種蛋白，Cry1Ac和Cry2Ab蛋白極顯著高于Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca，而Cry1Ah蛋白極顯著高于Cry2Aa，Cry1Ca蛋白極顯著低于Cry2Aa。Cry1Ac、Cry1Ab和Cry2Ab處理的初孵幼蟲體重抑制率極顯著高于Cry1Ah和Cry2Aa蛋白處理，而Cry1Ca處理下的棉鈴蟲體重抑制率則極顯著低于Cry1Ah和Cry2Aa蛋白；6種蛋白處理的1齡幼蟲的體重抑制率的多重比較結(jié)果與初孵幼蟲相同(圖1)。

2.3 不同Bt蛋白處理棉鈴蟲2齡幼蟲后的體重變化

棉鈴蟲2齡幼蟲取食含不同Bt蛋白的飼料后，不同處理間幼蟲體重有極顯著性差異(1 d，df=6，F(xiàn)=175.29，P<0.0001；3 d，df=6，F(xiàn)=94.77，P<0.0001；7 d,df=6，F(xiàn)=66.42，P<0.0001；9 d，df=6，F(xiàn)=924.33，P<0.0001)。多重比較結(jié)果表明，對照和Cry1Ca處理之間棉鈴蟲的體重在1、3、7和9 d均沒有顯著差異；Cry1Ac、Cry1Ab處理下的2齡幼蟲僅在9 d后體重極顯著高于Cry2Ab蛋白；而Cry1Ah處理下的幼蟲體重僅在7 d后顯著低于Cry2Aa，而在1、3和9 d后均是極顯著低于該蛋白。與Cry2Ab相比，Cry1Ah處理下的幼蟲體重僅在1 d后極顯著增加，其他時間段均沒有顯著差異(表2)。

2.4 不同Bt蛋白處理棉鈴蟲2齡幼蟲后的生物學(xué)參數(shù)差異

棉鈴蟲2齡幼蟲取食含不同Bt蛋白的飼料后，不同處理間除了蛹期顯著差異外，其他生物學(xué)參數(shù)均為極顯著差異(11 d后幼蟲死亡率，df=6，F(xiàn)=9.47，P=0.0006<0.001；幼蟲發(fā)育歷期，df=4，F(xiàn)=183.54，P<0.0001；化蛹率，df=6，F(xiàn)=97.92，P<0.0001；蛹重，df=6，F(xiàn)=27.92，P<0.001；蛹期，df=4，F(xiàn)=6.41，P=0.0129<0.05；羽化率，df=6，F(xiàn)=107.37，P<0.0001)。Cry1Ac和Cry1Ab蛋白處理下11 d后棉鈴蟲的死亡率顯著高于其他4種蛋白，差異不顯著。用Cry1Ac和Cry1Ab蛋白處理的棉鈴蟲無法完成整個幼蟲發(fā)育歷期，而用Cry1Ah、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry1Ca和對照處理的棉鈴蟲幼蟲發(fā)育歷期均有顯著差異，幼蟲發(fā)育歷期的順序為CK

圖1 1.0 μg·g-1不同Cry蛋白對棉鈴蟲初孵幼蟲和1齡幼蟲校正死亡率和體重抑制率的影響Fig.1 Abbott-corrected mortality rates and weight inhibition rates caused by active Cry proteins against the newly hatched and first-instar larvae of cotton bollworm (H.armigera) fed with 1.0 μg of toxin /g food圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱子上不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏法多重比較差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The data in the figure are mean±SE, and bars with the different letters above are significantly different by Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly extremely significant differences (P<0.01), and small letters, show significant differences (P<0.05).

處理Treatment棉鈴蟲幼蟲體重 Cotton bollworm larval body weight (mg)1 d3 d7 d9 dCry1Ac1.28±0.22dD1.50±0.51dC3.50±1.26dD8.92±1.61dDCry1Ab0.98±0.03dD1.89±0.14dC8.07±2.01dD15.41±3.63dDCry2Ab1.17±0.18dD3.02±0.96cdC30.45±3.30cC68.89±6.67cCCry1Ah1.86±0.17cC4.52±0.20cC33.23±3.26cBC67.35±11.70cCCry2Aa3.13±0.10bB12.45±1.09bB72.97±8.85bB158.87±0.85bBCry1Ca4.46±0.57aA18.87±2.78aA188.09±31.36aA331.63±9.14aACK3.62±0.19aA16.73±0.78aA175.97±32.38aA336.54±11.65aA

表中不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏法多重比較差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters represent significant differences among treatments when using a Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly significant differences (P<0.01) and small letters, significant differences (P<0.05).

表3 1.0 μg ·g-1的6種Bt蛋白分別處理棉鈴蟲2齡幼蟲后生物學(xué)參數(shù)的顯著差異Table 3 Responses of cotton bollworm fed with 1.0 μg of the six types of Bt proteins /g food

表中不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan氏法多重比較差異顯著，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters represent significant differences among treatments when using a Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly significant differences (P<0.01) and small letters, significant differences (P<0.05).

3 討論

本文系統(tǒng)測定了Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6種蛋白對棉鈴蟲幼蟲的毒力，國內(nèi)外也有一些文獻(xiàn)報道了Cry蛋白對棉鈴蟲毒力(韓嵐嵐等，2008；Leeetal.,1996; Chakrabartietal.,1998; Kaliaetal.,2005; Li & Bouwer,2012)。

在澳大利亞，已報道只有Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa和Cry2Ab蛋白能夠在可接受的劑量下殺死棉鈴蟲，而Cry1Ca被認(rèn)為對棉鈴蟲是無毒的(Liaoetal.,2002)。在印度，Cry1Ac對棉鈴蟲幼蟲的毒力最大，Cry1Ab和Cry1Aa次之(Kaliaetal.,2005)。在南非，Cry1Ac和Cry2Aa對棉鈴蟲的毒力最大，Cry1Ab次之，Cry1Aa毒性較小(Li & Bouwer,2012)。在中國，Cry1Ac被認(rèn)為是對棉鈴蟲幼蟲毒力最強(qiáng)的Cry蛋白，Cry2Ab次之，此外，Cry1Ah對棉鈴蟲幼蟲也有一定的殺蟲活性，但由于純化時易形成寡聚體導(dǎo)致其殺蟲活性不很穩(wěn)定(韓嵐嵐等，2008; 周子珊等，2011)。而本試驗中測得的LC50顯示，Cry1Ab和Cry1Ac對棉鈴蟲幼蟲的毒力最強(qiáng)，Cry2Ab次之，Cry1Ah和Cry2Aa對棉鈴蟲幼蟲毒性較低。由此可見，不同國家和地區(qū)的棉鈴蟲種群對同一Bt毒素的敏感性存在差異，其原因可能是長時間的地理隔離。

估算棉鈴蟲田間種群抗性基因頻率時，一般采用Wuetal.(1999)確定的1.0 μg·mL-1飼料為診斷濃度。李海強(qiáng)等(2012)對新疆北部地區(qū)轉(zhuǎn)Bt基因棉外源蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)4個品種苗期葉片的Bt(Cry1Ac)蛋白含量平均為1.0 μg·g-1左右時，對當(dāng)?shù)孛掴徬x有較好的控制作用。本試驗以相同質(zhì)量濃度(1.0 μg·g-1)的6種Bt蛋白分別對棉鈴蟲初孵幼蟲、1齡幼蟲和2齡幼蟲進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)Cry1Ab和Cry1Ac對3種發(fā)育狀態(tài)下的棉鈴蟲幼蟲毒性均是最強(qiáng)，用這2種蛋白對2齡幼蟲連續(xù)處理，棉鈴蟲羽化率為0，不能完成整個生長發(fā)育。Cry2Ab對2齡前的幼蟲控制效果較好，但對2齡幼蟲控制較差；而Cry1Ah和Cry2Aa對2齡前的棉鈴蟲毒力接近，LC50幾乎相近，但兩者對2齡幼蟲控制效果卻相差很大，可能是由于Cry1Ah蛋白純化過程中形成了寡聚體，殺蟲活性不穩(wěn)定引起的(周子珊等，2011)。

為了阻止或推遲靶標(biāo)害蟲對Cry1Ac蛋白抗性的產(chǎn)生，人們提出了多基因策略，即將多個Bt基因同時轉(zhuǎn)入植物中用來控制農(nóng)田害蟲，Cry1Ac和Cry2Aa、Cry1Ac和Cry2Ab可被同時轉(zhuǎn)入植物中控制棉鈴蟲，因為這2個蛋白可使用不同的受體結(jié)合位點(Cacciaetal.,2010；Gahanetal.,2005)。對Cry1Ac產(chǎn)生抗性的棉鈴蟲品系，對Cry2Aa和Cry2Ab是敏感的(Akhursttetal.,2003)。而對Cry2Ab產(chǎn)生抗性的棉鈴蟲品系，則被認(rèn)為對Cry2Aa也有抗性，但對Cry1Ac敏感(Mahonetal.,2007)。盡管Cry2Ab、Cry2Aa和Cry1Ah對棉鈴蟲幼蟲的毒性不如Cry1Ab和Cry1Ac，但是仍然可以作為控制中國棉鈴蟲幼蟲的替代策略。

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