陳韶萍， 黃 振， 郭瓊霞*， 劉長明

1福建出入境檢驗檢疫局,福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建 福州 350001 2福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002

實蠅類害蟲隸屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，約有500屬4500種，除了南極與北極這2個高緯度區(qū)域，實蠅在全世界的熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)均有分布(梁廣勤等，2008；王振華等，2009)。世界上具有重要經(jīng)濟意義的實蠅主要分為5個類群，即按實蠅屬Anastrepha、果實蠅屬Bactrocera、寡鬃實蠅屬Dacus、臘實蠅屬Ceratitis以及繞實蠅屬Rhagoletis(黃振和黃可輝，2012; 梁廣勤等，2008)。我國有實蠅400余種，絕大多數(shù)種類為水果、蔬菜和花卉作物的害蟲，約有15屬22亞屬150余種，其中70余種被認為是具有危險性或潛在危險性的重要害蟲(黃振，2010)；同時其危害的寄主范圍廣，在進境口岸經(jīng)常被截獲(黃振等，2012、2014)。

長期以來，實蠅類害蟲的口岸檢疫鑒定主要以完整的成蟲外部形態(tài)特征為依據(jù)。然而，在口岸中經(jīng)常截獲的大多是實蠅幼蟲，在這種情況下，通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲再進行鑒定，因其需要花費較長的時間，從而影響果蔬進出口貿(mào)易的通關(guān)速度。近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學技術(shù)被用于昆蟲分類鑒定，如同工酶技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)、PCR技術(shù)、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、基因芯片技術(shù)等。這給實蠅分類鑒定帶來了契機，即在傳統(tǒng)分類的基礎(chǔ)上借助分子手段，可以更好地解決實蠅物種鑒定問題。本文主要對目前已經(jīng)被用于實蠅鑒定的分子生物學技術(shù)的優(yōu)缺點及其國內(nèi)外研究進展進行綜述，以期為今后選用分子生物學技術(shù)鑒定實蠅種屬提供參考。

1 DNA條形碼技術(shù)

1. 1 原理及特點

2003年，加拿大動物學家Paul Hebert博士提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念。DNA條形碼技術(shù)的原理類似于商品條形碼，關(guān)鍵是對物種的某一段標準目的基因片段進行大范圍比對分析，進而識別、鑒定未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種及隱存種等(Hebertetal.，2003)。近年來，由于DNA條形碼技術(shù)操作快速簡便、結(jié)果準確性高以及可進行非專家物種鑒定等特點，為生物分類學提供了信息化的分類標準和有效的分類手段，成為目前發(fā)展速度最快的前沿學科之一。

目前，被選作標記的分子基因很多，但僅COⅠ (cytochrome oxidase Ⅰ或coxⅠ) 基因被選為DNA條形碼的靶標基因。COⅠ基因是位于線粒體呼吸鏈上的編碼細胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因，該基因具有幾個特點(Lin & Danforth,2004)：(1)大部分為母系遺傳，相對保守且沒有內(nèi)含子，不包含重復序列；(2)與其他基因相比，進化速率較快；(3)AT含量較高，且在細胞內(nèi)為多拷貝，比較容易被擴增。此外，COⅠ基因有足夠的變異能夠?qū)⒉煌锓N區(qū)分開。

1. 2 國內(nèi)外研究進展

李志紅等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)成功鑒定了采自泰國四色菊市番石榴爛果中的番石榴實蠅Bactroceracorrecta(Bezzi)幼蟲。Abd-El-Samie & El Fiky (2011)基于COⅠ序列，分析闡述了在埃及各地區(qū)建立種群的桃實蠅Bactrocerazonata(Saunders)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。姜帆等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)和BOLD系統(tǒng)，對廣西南寧地區(qū)苦瓜中的實蠅幼蟲樣品進行了序列測定、比對和分析。Liangetal.(2011)利用試驗獲得的25種實蠅的155條COⅠ序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析，證實了COⅠ條形碼序列能準確鑒定、識別除橘小實蠅Bactroceradorsails(Hendel)復合種外的中國果實蠅種屬。Liuetal.(2011)基于形態(tài)學及COⅠ條形碼序列，成功鑒定了來自布隆迪的入侵果實蠅BactrocerainvadensDrew。劉慎思等(2012)利用DNA條形碼技術(shù)構(gòu)建實蠅類害蟲快速鑒定技術(shù)體系，并證實該物種識別技術(shù)可用于口岸截獲的實蠅類害蟲幼體及殘體的準確鑒定。Jiangetal.(2013)利用DNA條形碼技術(shù)，基于SNP位點設(shè)計了能夠準確鑒定、識別番石榴實蠅的特異性引物。

1. 3 實蠅DNA條形碼的應用情況

根據(jù)BOLD Systems現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，總結(jié)了截至2014年10月22日實蠅DNA條形碼的種類、已公布的記錄數(shù)及其涉及的實蠅種類(表1)。由表1可以看出，實蠅DNA條形碼的種類主要有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7種。其中以COⅠ標記為主，已公布的記錄數(shù)為4540，是其他5種DNA標記的113. 5倍，其中又以COⅠ-5P標記為主，研究的實蠅種類達315種，COⅠ-3P標記的有116種；果實蠅屬被研究公布的記錄數(shù)最多，其次為臘實蠅屬和寡鬃實蠅屬；BOLD Systems數(shù)據(jù)庫目前以COⅠ-5P標記的果實蠅屬種類達61種，寡鬃實蠅屬達70種，臘實蠅屬55種，按實蠅屬11種，繞實蠅屬12種。

2 以PCR(polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)特異性擴增快速鑒定技術(shù)

2. 1 常規(guī)PCR技術(shù)

2. 1. 1 原理及特點 PCR，即聚合酶鏈式反應，由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年建立，是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的技術(shù)，其反應體系主要包括DNA靶序列、引物、4種dNTP、DNA聚合酶以及適合的緩沖液體系，由高溫變性、低溫退火、適溫延伸3步為一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA序列得以擴增(王廷華等，2005)。該技術(shù)操作快速簡便、特異性強及靈敏度高，但是具有易被污染、易出現(xiàn)假陽性和假陰性等缺點。

2. 1. 2 國內(nèi)外研究進展 余道堅等(2004)利用mtDNA COⅠ部分序列，通過對大量的實蠅基因序列進行分析比較，設(shè)計出2對特異性引物，應用定性PCR技術(shù)成功檢測、鑒定了番石榴實蠅。崔俊霞等(2006)采用形態(tài)學觀察與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，成功鑒定了從臺灣水果中截獲的疑似橘小實蠅的幼蟲和蛹。王振華等(2008)采用PCR方法，利用ITS間斷序列分型引物，根據(jù)擴增后片段的不同，區(qū)分橘大實蠅Bactroceraminax(Enderlein)與橘小實蠅?？浊锷彽?2010)利用特異的嵌套式引物對橘小實蠅18S rDNA基因片段進行擴增和序列比對分析，成功鑒定了柑橘果實中橘小實蠅的卵。

表1 實蠅DNA條形碼的應用情況Table 1 The application of DNA barcoding for fruit fly identification

2. 2 Real-time PCR技術(shù)

2. 2. 1 原理及特點 Real-time PCR，即實時熒光定量PCR技術(shù)，于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，即指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法(歐陽松應等，2004)。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。目前該技術(shù)已得到廣泛應用。

2. 2. 2 國內(nèi)外研究進展 余道堅等(2006)基于mtDNA COⅠ設(shè)計引物，建立了SYBR Green實時熒光PCR技術(shù)快速鑒定辣椒實蠅Bactroceralatifrons(Hendel)的方法。Fengetal.(2007)基于mtDNA COⅠ，應用實時熒光定量PCR技術(shù)成功鑒定了三葉斑潛蠅Liriomyzatrifolii(Burgess)幼蟲。徐浪等(2010)基于mtDNA COⅠ設(shè)計6條特異性引物，應用AllGlo實時熒光PCR方法成功鑒定了南美按實蠅Anastrephafraterculus(Wiedemann)、墨西哥按實蠅Anastrephaludens(Loew)、西印度按實蠅Anastrephaoblique(Macquart)、印加按實蠅AnastrephadistinctaGreene、中美按實蠅AnastrephastriataSchiner等6種重要的按實蠅。

2. 3 RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術(shù)

2. 3. 1 原理及特點 RFLP，即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，于1980年由Bostein建立并發(fā)展起來。它是指利用限制性內(nèi)切酶酶解樣品DNA從而產(chǎn)生不同長度的DNA片，進而通過電泳將不同長度的DNA片段分離出來(周延清，2005)。該技術(shù)具有多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點，但存在成本昂貴、操作繁瑣、檢測周期長等缺點。

2. 3. 2 國內(nèi)外研究進展 Muraji & Nakahara (2002)應用RFLP技術(shù)研究了亞太地區(qū)18種實蠅的快速鑒定方法，結(jié)果表明，除了楊桃實蠅BactroceracarambolaeDrew & Hancock和木瓜實蠅BactrocerapapayaeDrew & Hancock，該方法可準確鑒別其他16種實蠅害蟲。吳佳教等(2004)研究表明，RFLP技術(shù)適用于橘小實蠅、銹實蠅Bactrocerarubigina(Wang & Zhao)、瓜實蠅Bactroceracucurbitae(Coquillett)、南瓜實蠅Bactroceratau(Walker)、具條實蠅Bactrocerascutellata(Hendel)及木姜子實蠅BactrocerahyalineShiraki等6種實蠅的快速鑒定。吳佳教等(2005)應用RFLP技術(shù)，對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實蠅進行了快速鑒定。林麗莉等(2007)應用RFLP技術(shù)，對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實蠅Bactroceratsuneonis(Miyake)和橘大實蠅開展了分子生物學鑒定方法的研究并取得成功。Chuaetal.(2010)采用RFLP技術(shù)成功區(qū)分了楊桃實蠅和木瓜實蠅，進而使橘小實蠅復合種的有效識別得以實現(xiàn)。

2. 4 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)技術(shù)

2. 4. 1 原理及特點 RAPD，即隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)，由美國杜邦公司和加利福尼亞生物研究所在1900年提出(Welsh & McClelland，1990；Williamsetal.，1990)。它以一種或多種隨機引物對模板DNA進行隨機擴增，是建立在PCR基礎(chǔ)上研究模板DNA多態(tài)性的遺傳標記技術(shù)。其基本原理是利用人工合成的短核苷酸(大約10個堿基)對DNA靶序列進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行電泳分離及溴化乙錠染色就可檢測出DNA靶序列的多態(tài)性(溫孚江，2002)。該技術(shù)具有操作簡便易行、分析快捷方便、不用專門設(shè)計引物及引物數(shù)量不限等優(yōu)點，但是存在穩(wěn)定性差、重復性差、易出現(xiàn)假帶等缺點。

2. 4. 2 國內(nèi)外研究進展 Haymer & McInnis (1994)應用RAPD技術(shù)鑒定了地中海實蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann)，認為RAPD技術(shù)可用于證明害蟲同一種群和不同種群間的遺傳變異。張紅梅等(2004)利用RAPD技術(shù)對陜西省常見4種實蠅基因組DNA的多態(tài)性進行了初步研究。張亮和張智英(2007)采用RAPD技術(shù)鑒定了南瓜實蠅、黑漆實蠅Bactrocerascutellaris(Bezzi)、具條實蠅、瓜實蠅、橘小實蠅和番石榴實蠅等6種實蠅。

2. 5 AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術(shù)

2. 5. 1 原理及特點 AFLP，即擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)，是一種基于PCR技術(shù)的選擇性擴增限制性片段的方法，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后在限制性片段兩端連接人工接頭作為擴增的模板，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結(jié)合位點(鞠秀芝等，2005)。該技術(shù)具有快速高效、多態(tài)性豐富、可靠性好等優(yōu)點，但同時存在分析成本高、對樣本DNA質(zhì)量要求較高等缺點。

2. 5. 2 國內(nèi)外研究進展 Kakouli-Duarteetal.(2001)采用AFLP技術(shù)準確區(qū)分了地中海實蠅和納塔爾小條實蠅CeratitisrosaKarsch。我國暫無相關(guān)報道。

2. 6 基因芯片技術(shù)

2. 6. 1 原理及特點 基因芯片是生物芯片的一種，又被稱作DNA芯片。其工作原理：經(jīng)過標記的待測樣本DNA與位于芯片上特定位置的探針雜交，根據(jù)堿基互補配對的原則確定靶DNA序列，最后經(jīng)激光共聚集顯微鏡掃描，利用計算機系統(tǒng)對熒光信號進行比較和檢測進而迅速得出所需信息(馮永強和閻小君，2000)。該技術(shù)具有快速高效、高通量、微型化以及自動化等優(yōu)點，但同時存在技術(shù)復雜、成本昂貴、檢測靈敏度低、重復性差及分析范圍較窄等缺點。

2. 6. 2 國內(nèi)外研究進展 李文芬等(2008)選擇mtDNA COⅠ作為分子標記基因，建立了地中海實蠅、芒果小條實蠅Ceratitiscosyra(Walker)以及納塔爾小條實蠅等實蠅科重要害蟲的生物芯片檢測方法。國外暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻。

3 問題與展望

近年來，分子生物學技術(shù)不斷發(fā)展，其在昆蟲分類中的應用也越來越廣，這些技術(shù)不僅驗證了傳統(tǒng)分類所得出的結(jié)論，而且解決了傳統(tǒng)分類所無法解決的疑難問題，均顯示出分子生物學技術(shù)的優(yōu)勢及廣闊的發(fā)展前景。

雖然分子生物學技術(shù)具有準確、客觀等特點，即分子序列的信息代表遺傳的本質(zhì)，它不受物種個體發(fā)育階段及環(huán)境條件等的影響，但同時存在許多問題。首先，從龐大的DNA文庫中選擇最佳、最能反映物種間進化關(guān)系的基因片段仍存在較大難度；其次，選擇不同的目的基因研究同一物種，可能會得到不同的結(jié)果；再次，使用不同的分子生物學分析軟件有可能得出不同的結(jié)果。這些問題是今后昆蟲分類研究的重要課題。

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