朱 軍，陳琴華，熊 琳，余 飛，李夢(mèng)穎，李 鵬

0 引言

亮菌甲素琥珀酸單酯(ASE)是采用前藥的設(shè)計(jì)方法，用琥珀酸酐將其結(jié)構(gòu)中的羥甲基酰化制成琥珀酸單酯，改善其水溶性。前期研究表明，亮菌甲素琥珀酸單酯增加膽汁分泌的作用強(qiáng)于亮菌甲素，對(duì)總膽管末端括約肌具有松弛效應(yīng)，有望成為一種優(yōu)良的肝膽用藥[1-2]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI/MSn)法是近年發(fā)展起來(lái)的適用于生物樣品定性定量分析的一種方法，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，能夠進(jìn)行在線分離和檢測(cè)[3-4]。本文采用LC-MS/MS法測(cè)定ASE在人血漿中的含量，為進(jìn)一步研究其藥動(dòng)學(xué)及其生物等效性實(shí)驗(yàn)提供新的思路。

1 材料與儀器

亮菌甲素琥珀酸單酯對(duì)照品(本研究所合成，批號(hào)：20090422，純度99.6%)；補(bǔ)骨脂甲素對(duì)照品(上海順博生物科技有限公司，批號(hào)：20100302，純度98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；乙酸銨、乙酸、三氯甲烷和乙醚為分析純。

十萬(wàn)分之一分析天平(Sartorius CP225D型，0.1 mg)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品，包括電噴霧離子化源(ESI)、LC/MS trap software 4.2工作站、DataAnalysis version 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，具有軟電離和多級(jí)離子阱質(zhì)譜功能；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司)；HP-01溶劑過(guò)濾器(杭州賽析科技有限公司)；日本島津AEU-210電子天平；TG16G離心儀；WH-1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；超速離心機(jī)(杭州賽析科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取ASE對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，即得1.0 mg/mL ASE儲(chǔ)備液，置冰箱冷藏備用。精密吸取配制好的ASE儲(chǔ)備液1.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，即得ASE工作液(濃度為100 μg/mL)。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取補(bǔ)骨脂甲素對(duì)照品(批號(hào)：20100302)10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇超聲溶解后稀釋至刻度，即得補(bǔ)骨脂甲素對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為1.0 mg/mL)，置冰箱冷藏備用。精密吸取補(bǔ)骨脂甲素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，即得補(bǔ)骨脂甲素工作液(濃度為50 μg/mL)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱(30 mm×2.1 mm，3.5 μm)。流動(dòng)相：甲醇(A)-20 mM乙酸銨水溶液梯度洗脫：5%A，1 min；1～4 min線性增加到95%A，保持8 min；最后降至5%A，并且基線平衡。流速：0.4 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。負(fù)離子模式下監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)離子分別為m/z333→233(ASE)和m/z323→221(內(nèi)標(biāo))。

2.3 樣品預(yù)處理[5]取空白人血漿0.5 mL于10 mL具塞試管中，分別加入ASE(100 μg/mL)和內(nèi)標(biāo)溶液(50 μg/mL)各50 μL，加入1%鹽酸100 μL，渦旋振搖0.5 min，加入三氯甲烷-乙醚(v∶v，1∶1)5.0 mL，渦旋振搖1.0 min，4 000 r/min離心10 min，精密吸取離心后的上清液4.0 mL，40 ℃條件下氮吹儀氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇超聲使溶解完全，10 000 r/min離心10 min，精密吸取20 μL該上清液進(jìn)樣分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白人血漿0.5 mL，精密加入一定量ASE對(duì)照品溶液(100 μg/mL)，置10 mL具塞試管中，配制系列血漿樣品，其中含ASE濃度為0.01、0.05、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/mL，按“2.3”項(xiàng)下樣品處理方法處理后進(jìn)行測(cè)定。以ASE和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對(duì)血漿濃度X進(jìn)行線性回歸，回歸方程：Y=0.863×10-3X+0.352，相關(guān)系數(shù)r=0.991 4，結(jié)果表明，ASE在0.01～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度均為0.5 ng/mL(S/N>3)。專屬性色譜圖見圖1，其保留時(shí)間分別為 6.1、7.5 min。表明該方法專屬性強(qiáng)，空白血漿對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.5 回收率和精密度試驗(yàn) 提取回收率：取人空白血漿溶液0.5 mL，分別精密加入一定量對(duì)照品溶液(1.0 μg/mL)和內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3項(xiàng)”處理樣品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得的結(jié)果用外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果ASE提取回收率為82%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為90%。

圖1 色譜圖

加樣回收率和精密度：取人空白血漿溶液0.5 mL，精密加入一定量對(duì)照品溶液(濃度分別為0.05、1.0、5.0 μg/mL)，按“2.3”項(xiàng)處理樣品，作為質(zhì)控樣品，制備每個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得結(jié)果用ASE和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值表示，帶入回歸方程計(jì)算回收率。同時(shí)考察1 d內(nèi)制備3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)樣品測(cè)定5次，計(jì)算RSD(日內(nèi)精密度)，以及在同一周內(nèi)不同日內(nèi)分別測(cè)定，計(jì)算RSD(日間精密度)。見表1。

表1 ASE在人血漿中的加樣回收率和精密度(μg/mL)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別制備3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各10份，分為2組，一組在25 ℃保存2 h，一組在-20 ℃保存1個(gè)月，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得結(jié)果與第1天結(jié)果比較，表明ASE可以在25 ℃下2 h和-20 ℃下1個(gè)月保存，見表2。

表2 ASE在人血漿中的穩(wěn)定性試驗(yàn)

3 討論

ASE分子結(jié)構(gòu)式中具有羧基，屬于弱酸性化合物，更易失去氫離子，在LC-MS分析中，易于負(fù)離子檢測(cè)，離子檢測(cè)極性和pH選擇的規(guī)則需要滿足：酸性樣品、增加pH值、pH值至少高于樣品pKa 2個(gè)單位。流動(dòng)相中的添加劑(乙酸銨、甲酸銨、乙酸、甲酸等)可以增加樣品在ESI中的離子化效率，使用乙酸銨和甲酸銨雖然可以增加ASE在ESI中的離子化效率，但是影響其在LC中的峰形，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙酸銨既可以增加其在ESI中的離子化效率，又可得到相對(duì)對(duì)稱的色譜峰形[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以5、10、15、20、25和30 mM乙酸銨作為添加劑，考察其分離和離子化效率，結(jié)果表明，乙酸銨濃度>25 mM時(shí)，ASE的離子化效率降低，因此，本實(shí)驗(yàn)選用20 mM乙酸銨作為流動(dòng)相添加劑。

參考文獻(xiàn)：

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