張 亮，侯文潔，錢智磊，周秋云，丁紅梓，王 潔

0 引言

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)每年會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬人死亡[1]。異煙肼(INH)是結(jié)核病初始治療方案中最重要的組成部分[2]。但有部分患者由于自身代謝能力的差異導(dǎo)致血藥濃度太低而最終治療失敗。乙酰異煙肼(AcINH)是INH最主要的代謝產(chǎn)物，也是肝毒性最大的物質(zhì)，是INH在肝臟內(nèi)經(jīng)乙?；桑撨^程分為快乙?；吐阴；瘍煞N類型，其治療效果和毒副作用有所不同。肝損害多見于快乙?；停@可能是因?yàn)镮NH在體內(nèi)被迅速代謝為AcINH而造成的。因此，可以通過監(jiān)測(cè)相同給藥間隔后AcINH的濃度來判斷患者乙?；念愋蚚3]，調(diào)整INH的給藥劑量以提高治療效率，減少毒副作用的發(fā)生。此外，肺結(jié)核的治療通常為聯(lián)合治療，而藥物聯(lián)用也會(huì)對(duì)INH的血藥濃度產(chǎn)生影響。因此，對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)是有必要的。

目前，已有高效液相色譜(HPLC)法分析抗結(jié)核藥物含量的報(bào)道[4-5]，但這些方法都不能用來分析成分極為復(fù)雜的血漿中的藥物濃度。也有報(bào)道使用HPLC同時(shí)測(cè)定血漿中的多組分抗結(jié)核藥，但使用了離子對(duì)試劑，后者成本過高且重現(xiàn)性較差[6]。液相—聯(lián)用(LC-MS)擁有超高的選擇性和靈敏度，可同時(shí)分析血漿中的多種藥物[7]，但其成本過高而且儀器在醫(yī)院尚未普及。因此，使用HPLC對(duì)多種抗結(jié)核藥及其代謝物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)依然是最常用和最經(jīng)濟(jì)的方法。本文對(duì)HPLC同時(shí)測(cè)定血漿中INH和AcINH進(jìn)行了方法學(xué)研究，并且使用本方法對(duì)30例患者血漿中的藥物濃度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)(檢測(cè)器為SPD-M20A，島津，日本)；渦旋儀(WH-2，上海滬西分析儀器廠有限公司)；電子分析天平(EB224，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(TG1650-WS，上海盧湘儀)；微量移液器(Eppendorf，德國(guó))。

1.2 試藥 異煙肼對(duì)照品(批號(hào)：100578-200401，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，乙酰異煙肼對(duì)照品(批號(hào)：3-JES-102-4，Toronto Research Chemicals Inc.)，茶堿對(duì)照品(批號(hào)：100121-199903，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.3 試劑 甲醇(Merck，德國(guó))為色譜純，磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)，中國(guó))、三乙胺(國(guó)藥集團(tuán)，中國(guó))均為分析純。水為自制雙蒸水(MILLIPORE，美國(guó))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(B,三乙胺調(diào)pH=5.6)(梯度：1～10 min梯度A∶B為4∶98，10～11 min梯度A∶B為80∶20，11 min梯度A∶B為80∶20，淋洗時(shí)間共20 min)，柱溫：40 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm。

2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品300 μL放入2 mL離心管中，精密加入2.4 μg/mL茶堿甲醇溶液10 μL作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，渦旋混勻1 min，加甲醇700 μL，渦旋混合5 min，16 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶。

2.3 方法專屬性試驗(yàn) 按照本方法，INH和AcINH有較好分離，互不干擾測(cè)定，血漿中的雜質(zhì)峰對(duì)樣品的測(cè)定也沒有影響。色譜圖見圖1。

圖1 INH和AcINH的色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品置于10 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配成濃度分別為INH 1 000 μg/mL、AcINH 1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取數(shù)支2 mL的離心管，每支加入不同量的INH和AcINH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及300 μL空白血漿，使血漿中藥物濃度為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 μg/mL。按“2.2”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，以濃度(C)為橫坐標(biāo)、樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別于300 μL的空白血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配置成含低、中、高3種不同濃度INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下操作，測(cè)定日內(nèi)(5次)和日間(5 d)精密度，RSD均<10%。見表2。

表2 日間、日內(nèi)精密度試驗(yàn)(n=5)

2.6 穩(wěn)定性考察 在300 μL的空白血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配置成含INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)濃度的血漿樣品，分別室溫放置0、2、4、8、12 h后按“2.2”項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。結(jié)果表明，測(cè)定基本保持穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 回收率試驗(yàn) 分別于300 μL的空白血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配置成含低、中、高3種不同濃度INH(0.5、5、25 μg/mL)、AcINH(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度測(cè)5遍，計(jì)算平均回收率和RSD。見表4。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果

3 血藥濃度檢測(cè)的應(yīng)用

本方法成功用于30例服用INH患者的血藥濃度檢測(cè)。服藥方法為INH 0.3 g，1次/d，早飯后0.5 h頓服。早飯后2.5 h采集血樣，并于3 h內(nèi)分析完畢，不能及時(shí)測(cè)試的保存在-40 ℃冰箱內(nèi)。測(cè)試結(jié)果表明，患者的血漿藥物濃度差異較大。INH血藥濃度為0.34～5.9 μg/mL，平均(1.9±0.61)μg/mL；AcINH血藥濃度為0.36～3.3 μg/mL，平均(1.75±0.59)μg/mL。

4 討論

由于INH和AcINH極性較強(qiáng)，導(dǎo)致其在色譜柱上保留時(shí)間過短，且易受血漿雜質(zhì)的影響。為了獲得良好的分離度和峰形，本試驗(yàn)曾嘗試使用苯基柱和氰基柱[8-9]，其雖可延長(zhǎng)保留時(shí)間，但峰形不滿意。經(jīng)過反復(fù)比較和試驗(yàn)，筆者認(rèn)為使用C18柱以pH 5.6的磷酸二氫鉀為緩沖對(duì)，在高極性流動(dòng)相的洗脫下可以得到很好的分離。

在血漿樣品處理方法中，本試驗(yàn)嘗試了液液萃取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于這三種組分的極性過大，用乙酸乙酯無法全部萃取，嚴(yán)重影響分析的準(zhǔn)確性。此外，本試驗(yàn)嘗試將沉淀蛋白后的上清液吹干后再用流動(dòng)相復(fù)溶，結(jié)果顯示，除了增加操作步驟、給方法學(xué)的考察增加了難度外，還需加入抗氧化劑，影響了多組分藥物的穩(wěn)定性。通過試驗(yàn)和對(duì)比，選擇使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液進(jìn)樣，該方法可以在不影響可靠性的前提下簡(jiǎn)化操作步驟，方便臨床大批量樣本的檢測(cè)。

本試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、成本較低，靈敏度不低于LC-MS，即使樣本中藥物的含量較低也能測(cè)定；保留時(shí)間較為合適，如果使用250 mm的C18柱還可以延長(zhǎng)保留時(shí)間，增加分離度；方法回收率高于80%，日間和日內(nèi)RSD<10%，完全符合生物樣品分析要求；可以用于臨床藥物檢測(cè)及藥物動(dòng)力學(xué)研究，可作為同行進(jìn)行抗結(jié)核藥物測(cè)定的參考。

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