吳海偉，賈燕花，王曉青，高 磊，薛謨斐，劉皈陽

0 引言

復(fù)方氯霉素醇溶液是《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[1](2002年增補(bǔ)版)(以下簡(jiǎn)稱“軍隊(duì)制劑規(guī)范”)中收載的一種外用制劑，具有抗菌、軟化角質(zhì)作用，臨床上主要用于治療脂溢性皮炎、皮疹、瘙癢癥等。復(fù)方氯霉素醇溶液中含有氯霉素、水楊酸兩種主成分，用75%乙醇作為溶劑配制而成。在《軍隊(duì)制劑規(guī)范》中，采用了高效液相法和中和滴定法分別測(cè)定復(fù)方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，該方法操作較繁瑣、耗時(shí)；因此，為了簡(jiǎn)化復(fù)方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量測(cè)定方法，提高專屬性、準(zhǔn)確性；本實(shí)驗(yàn)擬建立高效液相法同時(shí)測(cè)定復(fù)方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，參考2010版《中國藥典》[2]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果，該方法能夠較準(zhǔn)確地測(cè)量復(fù)方氯霉素醇溶液的含量，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Aglient1200型高效液相色譜儀，Eclips XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，美國Aglient公司；紫外分光光度儀，U-3000，日本日立株式會(huì)社；電子天平，Mettler AE200，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試藥 氯霉素對(duì)照品(批號(hào)：100508-200902，中國藥品生物制品鑒定所)，水楊酸對(duì)照品(批號(hào)：100106-201104，中國藥品生物制品鑒定所)，氯霉素原料藥(批號(hào)：CH130313，南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司)，水楊酸原料藥(批號(hào)：10092，山東新華制藥股份有限公司)，乙酸(分析純，北京化工廠)，甲醇(色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司)，復(fù)方氯霉素醇溶液(本院自制，批號(hào)：130911-1、130911-2、130911-3，規(guī)格：100 mL/瓶)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對(duì)照品液液的制備 稱取氯霉素對(duì)照品約50.0 mg，水楊酸對(duì)照品約50.0 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密量取5 mL置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方氯霉素醇溶液2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 空白溶液的制備 根據(jù)處方比例，配制不含氯霉素、水楊酸的空白樣品，并按“2.1.2”項(xiàng)配制空白溶液。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 稱取等量氯霉素、水楊酸對(duì)照品適量，用適量甲醇溶解，流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)濃度，在紫外分光光度儀下，400～200 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果，氯霉素與水楊酸混合溶液在293.2 nm處有最大吸收值(見圖1)；因此，檢測(cè)波長(zhǎng)確定為293 nm。

2.3 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；以1%冰醋酸-甲醇(60∶40)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為293 nm；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

圖1 氯霉素、水楊酸混合溶液全波長(zhǎng)掃描

2.4 專屬性試驗(yàn) 取本品制劑2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，共3份；分別加入10 mL 1 mol/L HCl溶液、10 mL 1 mol/L NaOH溶液及10 mL雙氧水，室溫放置60 h，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻；精密量取適量，用流動(dòng)相稀釋10倍，即為供試品溶液；分別取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液及空白溶液10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，該制劑在酸、堿及氧化條件下，均有雜質(zhì)峰出現(xiàn)，但均不干擾主峰，且兩主峰分離較好，分離度大于2，如圖2所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備液3、4、5、6、7、8 mL置于50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL以對(duì)照品峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，氯霉素、水楊酸線性回歸方程分別為：A=14.42C-2.101,r=1；A=11.97C-53.21,r=1。表明氯霉素、水楊酸在60～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.6 樣品測(cè)定

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品貯備液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻；取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算得氯霉素峰面積RSD值為0.11%(n=6)，水楊酸峰面積RSD值為0.08%(n=6)；表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置24 h，每隔2 h進(jìn)樣一次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，計(jì)算氯霉素、水楊酸峰面積的RSD值分別為0.12%、0.10%；表明本溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，其峰面積基本不變。

2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 選擇同一批復(fù)方氯霉素醇溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算得氯霉素峰面積RSD值為0.80%(n=6)，水楊酸峰面積RSD值為0.34%(n=6)；表明樣品含量測(cè)定重復(fù)性較好。

圖2 對(duì)照品及樣品高效液相色譜圖

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 稱取氯霉素、水楊酸原料藥各約40、50、60 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，按處方比例加入輔料，適量甲醇溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2.5 mL溶液，置于25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即制得濃度為80%、100%、120%的供試品溶液，每個(gè)濃度組制備3份。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖；結(jié)果氯霉素平均回收率為99.45%，RSD值為0.46%，水楊酸平均回收率為100.32%，RSD值為0.97%。結(jié)果見表1、表2。

2.7 耐用性考察 為考察該色譜條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，擬在改變下列色譜條件的情況下，對(duì)供試品進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算每個(gè)條件下含量測(cè)定的RSD值。(1)改變流速±0.2 mL/min：0.8 mL/min；1.0 mL/min；1.2 mL/min。(2) 改變流動(dòng)相比例±2%：1%冰醋酸∶甲醇=58∶42；1%冰醋酸∶甲醇=60∶40；1%冰醋酸∶甲醇=62∶38。(3)改變波長(zhǎng)±5 nm：288 nm；293 nm；298 nm。(4)色譜柱：①Eclipse plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。②ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；③Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)

表1 氯霉素

表2 水楊酸

取復(fù)方氯霉素醇溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試液，在上述色譜條件，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明：在改變流動(dòng)相比例、流速、波長(zhǎng)及色譜柱條件下，供試品的測(cè)定含量均符合要求，各條件下含量測(cè)定的RSD值均小于2%，說明該方法用于樣品含量測(cè)定，耐用性較好。結(jié)果見表3。

2.8 樣品含量測(cè)定 取復(fù)方氯霉素醇溶液三批(批號(hào)：130911-1、130911-2、130911-3)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定3批樣品中氯霉素含量分別為98.52%、99.76%、98.92%，水楊酸的含量分別為99.06%、100.97%、99.27%。結(jié)果表明：三批樣品中氯霉素和水楊酸的含量均符合要求，結(jié)果見表4。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立高效液相法同時(shí)測(cè)定復(fù)方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，該方法簡(jiǎn)單、方便，避免了《軍隊(duì)制劑規(guī)范》中分別測(cè)定水楊酸、氯霉素含量的繁瑣步驟。該方法與《軍隊(duì)制劑規(guī)范》中氯霉素含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件相比，流動(dòng)相配制更簡(jiǎn)單，對(duì)主成分出峰時(shí)間影響較小，提高了含量測(cè)定的準(zhǔn)確度。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方氯霉素醇溶液中氯霉素和水楊酸的含量，采取單一檢測(cè)波長(zhǎng)，例如278 nm，但水楊酸的最大吸收波長(zhǎng)為301 nm(經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè))，在278 nm處氯霉素與水楊酸的吸收強(qiáng)度差別較大，不適合作為兩者的共同檢測(cè)波長(zhǎng)；也有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，采用雙波長(zhǎng)雙通道法檢測(cè)該制劑中氯霉素和水楊酸的含量，即在278和300 nm處分別檢測(cè)氯霉素和水楊酸的色譜峰；而王敏等[7]人采用了單波長(zhǎng)切換的方法測(cè)定復(fù)方氯霉素醇溶液的含量，但考慮基層設(shè)備條件問題，均不適合作為制劑標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范收載。因此，本實(shí)驗(yàn)選取氯霉素、水楊酸混合液的最大吸收波長(zhǎng)293 nm，作為本品制劑含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)；在293 nm處，氯霉素與水楊酸的吸收值相近，能同時(shí)滿足兩者檢測(cè)的需要，有利于提高含量測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度。本方法應(yīng)用于復(fù)方氯霉素醇溶液的含量測(cè)定，并做了重復(fù)性、耐用性等試驗(yàn)的考察，結(jié)果均較好，可用于該制劑質(zhì)量的控制。

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