李慧玲，劉祖艷，趙 敏*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.l.78)是一種內(nèi)切水解酶，可以斷裂β-1，4-D-甘露糖苷鍵，其屬于半纖維素酶類(lèi)［1－2］。人們研究β-甘露聚糖酶始于20世紀(jì)50年代末60年代初，1958年Courtios［3］等首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-甘露聚糖酶的真菌;1960 年 Williams和 Doetsch［4］從細(xì)菌中得到 β-甘露聚糖酶;1965年Shibata和Reese［5］第1次提出β-甘露聚糖酶的概念。目前β-甘露聚糖酶已經(jīng)在醫(yī)藥衛(wèi)生、紙漿漂白、功能低聚糖的研發(fā)和石油開(kāi)采等方面得到廣泛應(yīng)用。

目前對(duì)β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌選育的主要手段是通過(guò)誘變育種方式進(jìn)行菌種改良，從而篩選到適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、繁殖力高的高產(chǎn)菌株。誘變育種具有操作簡(jiǎn)便、速度快、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。該研究采用紫外線(xiàn)和甲基磺酸乙酯相結(jié)合的誘變方法，提高了β-甘露聚糖酶的活力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株。東北林業(yè)大學(xué)微生物及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株Bacillus subtilis WD23。

1.1.2 主要培養(yǎng)基。產(chǎn)酶培養(yǎng)基:魔芋膠30 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 4 g/L，KNO36 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 為 8.0。初篩培養(yǎng)基:魔芋膠 3 g/L，CaCl20.5 g/L，KH2PO40.05 g/L，NaCl 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，KNO30.7 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定。取適量菌體接入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)約12 h。取種子液1 ml移入到50 ml LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，間隔2 h取樣測(cè)菌液的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。每次測(cè)量取3組平行。

1.2.2 出發(fā)菌株產(chǎn)酶歷程的測(cè)定。取適量菌體接入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h左右。將600 μl種子液移入魔芋膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)。間隔2 h取樣，用DNS方法測(cè)定發(fā)酵液中酶的活性。每次測(cè)量取3組平行。

1.2.3 酶活測(cè)定。采用改進(jìn)的3，5-二硝基水楊酸法(DNS方法)測(cè)定酶活力［6］。

1.2.4 菌株的紫外誘變。將菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期，用生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度為108cfu/ml。紫外燈下照射劑量分別為0、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s。用無(wú)菌生理鹽水稀釋誘變菌液和未誘變菌液，涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算致死率，致死率=(對(duì)照菌液的活菌數(shù)－處理菌液的活菌數(shù))/對(duì)照菌液的活菌數(shù)×100%。隨機(jī)選取120個(gè)誘變后的菌株點(diǎn)種在魔芋膠初篩培養(yǎng)基上，首先測(cè)量單菌落直徑，再加入剛果紅染液染色，測(cè)量透明水解圈直徑，計(jì)算H/C比值。選擇H/C比值較高的菌株采用DNS方法進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.5 菌株的甲基磺酸乙酯誘變。選擇紫外誘變活性最高的菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變。用磷酸緩沖液洗滌菌體，制備菌懸液濃度為108cfu/ml。EMS的使用濃度是1%(V/V)。誘變5、10、15、20、25、30 min。用無(wú)菌生理鹽水稀釋誘變菌液和未誘變菌液，涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算致死率，初篩和復(fù)篩的方法同紫外誘變。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 由圖1可看出，在培養(yǎng)初期菌體數(shù)量較少，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加菌體數(shù)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)約13 h時(shí)菌體數(shù)量達(dá)到最大值，隨后菌體數(shù)量開(kāi)始下降，所以紫外誘變時(shí)液體培養(yǎng)時(shí)間確定為13 h。

2.2 出發(fā)菌株的產(chǎn)酶歷程 出發(fā)菌株產(chǎn)酶歷程如圖2所示，發(fā)酵初期菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶水平較低，在發(fā)酵培養(yǎng)11 h時(shí)OD值最高，由于OD值與酶活性成正相關(guān)，所以這時(shí)酶活力最高。以此確定發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間為11 h。

圖1 B.subtilis WD23生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 紫外誘變結(jié)果

2.3.1 紫外誘變的致死率。根據(jù)誘變劑量選擇原則，紫外誘變致死率在70% ～80%時(shí)，正突變率最高。所以，紫外照射時(shí)間選為20～30 s。

2.3.2 初篩和復(fù)篩結(jié)果。經(jīng)剛果紅染色后，測(cè)量水解圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算H/C比值，H/C比值大說(shuō)明降解底物的能力強(qiáng);菌落直徑大說(shuō)明菌落適宜在該環(huán)境中生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，分別選擇20株正突變菌株，進(jìn)行復(fù)篩。DNS方法測(cè)定初篩所得的20株突變株，最終獲得的酶活最高的正突變菌株為B.subtilis W12(酶活力為3 532.01 U/ml)，出發(fā)菌株酶活力為3 248.82 U/ml，紫外誘變使酶活力提高8.72%。

圖2 B.subtilis WD23的產(chǎn)酶歷程

2.4 甲基磺酸乙酯誘變結(jié)果

2.4.1 甲基磺酸乙酯誘變致死率。甲基磺酸乙酯屬于化學(xué)誘變劑，該研究中誘變劑濃度選為1%。甲基磺酸乙酯對(duì)菌體的致死率在70% ～80%之間，正突變率最高，所以菌株B.subtilis W12的甲基磺酸乙酯誘變時(shí)間選為10 min。

2.4.2 初篩和復(fù)篩結(jié)果。在初篩平板選擇20株正突變菌株，進(jìn)行復(fù)篩。測(cè)定初篩所得的20株突變株，最終得到的酶活最高的突變菌株 B.subtilis WL-12，酶活力為3 577.57 U/ml，甲基磺酸乙酯使酶活力提高了1.29%。

3 討論

微生物的誘變育種包括物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變，其中經(jīng)常應(yīng)用的紫外線(xiàn)誘變和甲基磺酸乙酯誘變。紫外線(xiàn)照射可以使DNA形成胸腺嘧啶二聚體，影響DNA正常復(fù)制和堿基的正常配對(duì)，最終引起基因突變［7］。甲基磺酸乙酯屬于烷化劑，堿基烷基化后影響mRNA正常轉(zhuǎn)錄，從而使蛋白質(zhì)表達(dá)紊亂而改變性狀。該研究中采用了紫外線(xiàn)、甲基磺酸乙酯分別誘變菌株，結(jié)果表明紫外線(xiàn)誘變效果好于甲基磺酸乙酯，也就是物理誘變效果好于化學(xué)誘變。

［1］MCCLEARY B V.β － mannanase［J］.Methods in Enzymology，1988，160:596－610.

［2］SCHOMBUG D，SALZMANN M.Enzyme Handbook［M］.Berlin:Springer－Verlay Berlin Heideberg，1991:1 －5.

［3］COURTIOS J E，PETEK F，KADA T.Research on galactomannans.II.Action of takadiastase on the galactomannan of lueeren［J］.Bull Soc Chem Biol，1958，40:2031 －2037.

［4］WILLIAMS P P，DOETSCH R N.Microbial dissimilation of galactomannan［J］.Gen Microbiol，1960，22:635 －644.

［5］REESE T，SHIBATA Y.β-Mannanase of fungi［J］.Can J Microbiol，1965，11:167－183.

［6］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959(31):426 －428.

［7］龐曉坤，曹德菊，花日茂.物理因子誘變技術(shù)在廢水生物處理中的應(yīng)用研究［J］.四川環(huán)境，2005，24(5):68 －71.