包夢醒，吳 新

（1.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 ，江蘇 蘇州215000；2.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州215000；3.蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇 蘇州215000）

從細菌基因工程到細胞基因工程，再發(fā)展到轉(zhuǎn)基因動物，科學家一直在努力探索生產(chǎn)藥用蛋白的更好方式。細菌結構簡單，操作簡單，但缺乏翻譯后加工機制，表達的重組蛋白需經(jīng)修飾才有活性，增加了生產(chǎn)的成本和工藝復雜性；哺乳動物細胞具有轉(zhuǎn)錄后加工修飾能力，但培養(yǎng)條件苛刻，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。1980年，第一只轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)，讓科學家們將生產(chǎn)藥用蛋白的希望轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)基因動物。

在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)最理想表達蛋白的場所就是乳腺，自從1987年Gorden首次成功地從轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中獲得了人類組織型溶酶原激活劑tPA以來［1］，乳腺生物反應器就成為各國科學家研究的熱點。美國的GTC公司、英國的PPL公司以及荷蘭的Pharming等公司投入大量資金研發(fā)乳腺生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白，目前已經(jīng)生產(chǎn)出100多種藥用蛋白，很多都已經(jīng)進入臨床階段。2006年和2009年，GTC公司用山羊乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶Ⅲ（ATryn）分別被歐洲藥監(jiān)局EMA和美國FDA批準，成為第一個被批準上市的轉(zhuǎn)基因動物生物反應器生產(chǎn)的藥物；2010年，荷蘭Pharming公司用轉(zhuǎn)基因兔生產(chǎn)的單克隆抗體藥物Ruconest，成為第二個獲得歐洲藥品管理局批準轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物。本文主要從乳腺生物反應器的概念、原理、特點、主要的轉(zhuǎn)基因技術及問題等進行綜述，以期為乳腺生物反應器的相關研究提供參考。

1 乳腺生物反應器的概念及原理

乳腺生物反應器（mammary gland bioreactor）亦稱為轉(zhuǎn)基因動物乳腺個體表達系統(tǒng)，是指利用哺乳動物乳腺特異性啟動子調(diào)控元件指導目的基因在乳腺中特異性表達，以期從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應器［2］。乳腺生物反應器的原理主要是利用雌性動物產(chǎn)仔后乳腺分泌乳汁的特點，利用乳蛋白基因的乳腺特異性調(diào)控成分驅(qū)動外源基因在動物乳腺中高效表達，從而在乳汁中源源不斷獲得外源性蛋白。

2 乳腺生物反應器的特點

轉(zhuǎn)基因生物反應器主要包括乳腺生物反應器、血液生物反應器、膀胱生物反應器、家禽生物反應器等，與其它轉(zhuǎn)基因生物反應器相比，乳腺生物反應器具有很多特點：

①乳汁是動物分泌的天然產(chǎn)物，經(jīng)常收集不會對動物造成健康損害；②產(chǎn)量高，以一頭奶牛產(chǎn)奶量10 000kg／年，蛋白含量3%，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的蛋白占總蛋白的1%對于藥用蛋白來說產(chǎn)量是非?？捎^的；③成本低，轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)奶是農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)過程，生產(chǎn)、管理成本都較現(xiàn)代生化制藥低；④乳腺分泌藥物蛋白，能對蛋白進行糖基化、脂化、磷酸化、羧化等修飾加工，產(chǎn)物更接近天然產(chǎn)物；⑤乳腺生物反應器一般生產(chǎn)蛋白就在乳腺系統(tǒng)，對其它動物身體系統(tǒng)幾乎不產(chǎn)生負面影響；⑥純化簡單，乳汁中蛋白種類較少，目的產(chǎn)物易純化。

3 乳腺生物反應器主要轉(zhuǎn)基因技術

乳腺生物反應器的構建過程主要包括以下幾個步驟：首先分離和改造目標基因，將目的基因與乳蛋白基因的啟動子結合，構建表達載體，將融合的基因注射到受精卵或者多潛能干細胞（ES細胞［3］、iPS細胞［4－5］等），再植入受體動物，使其懷孕產(chǎn)下能表達藥物蛋白的轉(zhuǎn)基因幼仔，最后使轉(zhuǎn)基因幼仔懷孕繁殖下一代，擴大轉(zhuǎn)基因種群。下面對涉及的關鍵步驟和技術進行簡單介紹。

3.1 構建表達載體

3.1.1 目的基因 從1987年從小鼠中獲得人類組織型溶酶原激活劑tPA以來，一百多種目的基因在乳腺生物反應器中獲得表達，AT－III、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶、干擾素、胰島素、血清白蛋白等產(chǎn)物都已經(jīng)成功獲得。理論上將，大部分蛋白質(zhì)都可以通過乳腺表達，但是因為乳腺生物反應器的特點，更適合生產(chǎn)正常情況下濃度低、翻譯后修飾復雜、其他表達體系難以表達或者表達量低、臨床用量較大的藥用蛋白。

3.1.2 調(diào)控序列 外源基因如果要在乳腺生物反應器中高效表達需要同時滿足兩個條件：一、目標產(chǎn)物能高效、特異地獲得表達并分泌到乳汁中，乳腺的特異表達序列成為研究的重點；二、構建的表達載體要處于開發(fā)和活躍的狀態(tài)。傳統(tǒng)表達載體一般選用某種乳蛋白基因的調(diào)控序列作為調(diào)控序列的核心元件，主要有β－酪蛋白基因 （BLG）基因、αS1－酪蛋白基因、β－乳球蛋白、乳清酸性蛋白基因（WAP）以及乳清白蛋白基因。反芻動物一般采用同一物種的啟動子，并以BLG最多；家兔、豬和鼠類則采用多采用嚙齒類WAP；不同乳蛋白調(diào)控元件也可以混用。

表達載體的構建一般有幾種類型：一、基于普通質(zhì)粒的表達載體，主要包括啟動子、增強子、激素應答區(qū)、位點控制區(qū)、核基質(zhì)黏附區(qū)、5＇和3＇非翻譯區(qū)、PolyA位點等調(diào)控元件，但是人工雕琢的痕跡明顯，容量較小，是早期研究較多的載體類型；二、基于酵母人工染色體的表達載體，酵母人工染色體（YAC）是新的大容量載體，主要包括著絲粒、端粒、復制原點。YAC的構建使在整個獨立轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)插入外源基因成為可能，保持了乳蛋白調(diào)控的天然狀態(tài)。三、基于基因敲入的表達載體，有時外源基因插入著絲粒這一類異染色質(zhì)區(qū)時，往往造成表達載體處于壓縮狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子根本無法接近。即使調(diào)控序列有效，外源基因也無法表達。這種現(xiàn)象叫作位點效應，即轉(zhuǎn)基因動物基因組中表達載體插入位點的鄰近序列對外源基因表達的影響［6］?；蚧蚯萌氲谋磉_載體主要指基因打靶，將帶啟動子的外源基因敲入一些開放的、活躍轉(zhuǎn)錄的位點，對克服位點效應有重要作用。

3.2 轉(zhuǎn)基因技術

目前制備乳腺生物反應器的主要技術有原核顯微注射技術、反轉(zhuǎn)錄病毒感染技術、精子介導的轉(zhuǎn)基因技術、胚胎干細胞介導技術等，各有優(yōu)勢也各有其局限性。

3.2.1 原核顯微注射技術 原核顯微注射技術是1980年由Gordon［1］等創(chuàng)建的經(jīng)典技術，主要是將目的基因直接注射到受精卵原核內(nèi)部。優(yōu)點：①外源基因分子大小基本不受限制；②操作相對簡單，轉(zhuǎn)基因個體整合率高，在雙原核注射時整合目的基因的小鼠能達到50%［7］；③研究較早，技術較成熟，已經(jīng)在小鼠、家兔、豬、山羊、綿羊等多種動物上獲得成功。缺點：①設備昂貴，成本高；②整合位點隨機，效率低、可能破壞重要的內(nèi)源基因，易導致所需基因失活或胚胎死亡；③不能再早期確定轉(zhuǎn)基因動物的性別，增加工作量。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA再整合到宿主染色體上，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因操作。Breme［8］和Schatten［9］等利用該技術獲得了轉(zhuǎn)基因奶牛和轉(zhuǎn)基因猴。優(yōu)點：①目的基因整合有序且較穩(wěn)定；②拷貝數(shù)和插入位點相對固定，在牛等某些特定動物上效率較高；缺點：①對插入的目的基因大小有限制；②插入有一定隨機性，容易產(chǎn)生嵌合體。

3.2.3 精子介導的轉(zhuǎn)基因技術 主要包括精子載體技術和胞內(nèi)精子注射技術。精子載體技術還未得到大多數(shù)科學家的認可，這個技術的原理主要是精子質(zhì)膜能結合DNA，反對者主要認為如果精子吸收DNA如此簡單的話，物種不可能這么穩(wěn)定地代代遺傳。CHEN等利用脂質(zhì)體介導的精子載體技術，獲到了表達GFP基因的家兔［10］。胞內(nèi)精子注射技術是由Perry等人首次提出，首先用去污劑、凍融或凍干等方法處理精子，和目的基因共孵育后注射到MⅡ期卵母細胞質(zhì)。操作及原理與顯微注射類似，但純合后代較多，目前只在小鼠中獲得了成功。

3.2.4 胚胎干細胞介導技術 胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES細胞）是一種從早期胚胎的囊胚內(nèi)細胞團（Inner Cell Mass，ICM）細胞或胎兒原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）經(jīng)分離、體外抑制分化培養(yǎng)得到的具有發(fā)育全能性 （或多能性 ）的細胞［11］，具有不斷自我更新和高度分化潛能的特點。胚胎干細胞介導技術主要是用外源基因轉(zhuǎn)染ES細胞，通過篩選、富集再轉(zhuǎn)移進囊胚，并轉(zhuǎn)移到個體內(nèi)進行培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物。該技術的優(yōu)勢主要有：①能提前確定性別并進行篩選；②能對基因進行加入、剔除或者替換等修飾。但是，目前該技術只在小鼠和大鼠上獲得成功，牛、羊、豬等大動物的乳腺生物反應器還未成功。近年來，干細胞研究領域不斷獲得新的研究成果，1999年發(fā)現(xiàn)了成體干細胞具有跨系跨胚層分化的“可塑性 ”；2006年，Takahashi和Yamanaka首次利用小鼠皮膚成纖維細胞成功獲得類似胚胎干細胞（embryonicstemcells，ES細胞）的多能干細胞［12］，命名為誘導多能干細胞 （induced pluripotent stem cells，iPS細胞 ），具有和ES細胞幾乎一樣的生物學特性，為牛、羊、豬等大動物的乳腺生物反應器的建立提供新思路。

3.2.5 基因打靶技術 基因打靶技術主要是利用外源基因與細胞基因組同源序列發(fā)生同源重組，對細胞基因組進行定點修飾的技術，實現(xiàn)對外源基因的定點整合?；虼虬蟹ㄖ苽淙橄偕锓磻飨啾仍缙诘娘@微注射法，具有定位準確和能對內(nèi)源基因修飾等特點。

根據(jù)打靶對象細胞的不同，可分為胚胎干細胞介導的基因打靶技術和體細胞介導的基因打靶技術。利用小鼠ES細胞的基因打靶技術現(xiàn)已成為一種常規(guī)技術，但目前利用ES細胞基因打靶技術對大動物的乳腺生物反應器的研制還未成功。2009年，青島森淼生物技術有限公司與青島森淼生物技術研究所研發(fā)的我國首個利用乳腺生物反應器生產(chǎn)的抗凝血酶Ⅲ蛋白純品研究成果通過國家級項目評估。該研究主要是采用基因打靶技術制備乳腺生物反應器，將藥物蛋白基因定點整合到山羊內(nèi)源的乳腺蛋白基因中，在國內(nèi)首次獲得藥用蛋白轉(zhuǎn)基因體細胞克隆奶山羊，構建成功3種重組藥用蛋白乳腺生物反應器，使我國成為繼美國GTC公司之后，世界上第二家擁有該技術的企業(yè)。

3.2.6 體細胞核移植技術 體細胞核移植技術的核心技術是克隆技術，主要是將目的基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細胞中，篩選出整合有目的基因或獲得相應的遺傳修飾的細胞后，克隆轉(zhuǎn)基因細胞系，然后將細胞核移入去核的卵細胞中，獲得的重構胚移入代孕母體，從而獲得轉(zhuǎn)基因個體。1997年，Schnieke等首次通過細胞核移植技術獲得表達凝血因子的綿羊乳腺生物反應器［13］。與經(jīng)典顯微注射法相比，具有效率高、生產(chǎn)周期短，預先決定性別，易于與基因打靶技術結合等優(yōu)勢。基因打靶技術的定點整合技術理論上能夠克服顯微注射技術的位置效應的缺點，這兩種技術相結合具有基因定點整合、高效特異性表達等優(yōu)勢，是未來乳腺生物反應器轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展方向。2000年，McCreath等通過基因打靶技術和核移植技術相結合，成功培育出乳汁中hAAT表達量0.65mg／mL的轉(zhuǎn)基因綿羊［14］。

3.3 純化技術

分離純化是乳腺生物反應器研制成功后，投入規(guī)?；a(chǎn)的下游關鍵步驟。因為目標種類的多樣性，所以分離純化對于特定的產(chǎn)物可能采取不同的分離步驟和方法。白倩等以國產(chǎn)高交聯(lián)度的快流速瓊脂糖為基質(zhì)，合成了不同配基密度的SP（Sulfopropyl，磺酸基）離子交換介質(zhì)，建立了乳腺生物反應器表達重組人乳鐵蛋白（Recombinant Human Lactoferrin，rHLF）的純化方法［15］；李由等通過重組蛋白和主要牛蛋白雜質(zhì)的物化性質(zhì)，計算制定了純化工藝 路線；采用硫酸銨沉淀去除IgG蛋白，進一步通過疏水層析的條件優(yōu)化分離同源LA蛋白得到重組人乳清白蛋白純品［16］。田陽等以離子交換、疏水作用、HPLC和凝膠過濾層析等方法對山羊乳腺生物反應器表達的人促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）進行分離純化并獲得96%以上的純品［17］。

4 問題和展望

雖然近年來乳腺生物反應器的研究取得很多突破性進展，但是它作為一個不太成熟的新興產(chǎn)物還存在很多問題。①轉(zhuǎn)基因動物前期研究投入大，成功率較低；②外源基因的改造及克隆等轉(zhuǎn)基因技術還不夠成熟；③目的基因的表達水平總體不高，表達量低，受位置效應制約；④獲得的目標蛋白與自然活性蛋白可能存在一定的差異性，后期的分離純化技術還不成熟；⑤轉(zhuǎn)基因方式獲得的蛋白對人體是否會產(chǎn)生不良影響也未可知。盡管乳腺生物反應器這種新型轉(zhuǎn)基因技術還存在各種缺陷，隨著研究的深入，轉(zhuǎn)基因技術的不斷完善和開發(fā)，我們有理由相信在不久的將來，乳腺生物反應器必將獲得成功和產(chǎn)業(yè)化，對人類的生活和生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的影響。

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