韓天雨，卜淑敏

(首都體育學(xué)院，北京 100191)

骨質(zhì)疏松是一種常見(jiàn)的慢性骨代謝性疾病，最典型的骨質(zhì)疏松是由絕經(jīng)引發(fā)雌激素缺乏導(dǎo)致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療目前仍具有挑戰(zhàn)性，正日益成為一個(gè)公眾健康問(wèn)題。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，可由成骨細(xì)胞分泌，是反映骨形成和骨轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要骨代謝生化指標(biāo)，常用作骨質(zhì)疏松診斷和治療的參考指標(biāo)[2]。鑒此，本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)內(nèi)外通用的去卵巢大鼠模型[3,4]，動(dòng)態(tài)觀察了去卵巢大鼠血清ALP水平和骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目的變化，旨在揭示ALP在去卵巢大鼠血清和骨髓細(xì)胞中的變化規(guī)律，為探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

721E型分光光度計(jì)：上海光譜儀器廠；尼康高級(jí)研究級(jí)正置生物顯微鏡：尼康儀器(上海)有限公司；細(xì)胞涂片離心機(jī)：湘雅離心機(jī)廠；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒：南京建成生物科技有限公司(A059-1)；NBT-BCIP染色試劑盒：北京中杉金橋生物科技有限公司(ZLI-9041)。

1.2 動(dòng)物手術(shù)與分組

SPF級(jí) 3月齡雌性未孕SD大鼠80只，體重(263.91±11.93) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(京)2011-0012]。無(wú)菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部進(jìn)行[SYXK(京)2011-0039]，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。自由飲水及進(jìn)食，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重分層后隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、假手術(shù)3、6、12、24周組以及去卵巢3、6、12、24周組，共計(jì)9組。除基礎(chǔ)組外，其他各組都進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)前三組大鼠均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，去卵巢組大鼠從背部切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組不切除卵巢，而將卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織切除。術(shù)后自由進(jìn)食水，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，假手術(shù)3周組2只、去卵巢6周組2只大鼠因腹部粘連在手術(shù)后2周內(nèi)死亡，最后納入實(shí)驗(yàn)的各組大鼠的數(shù)目分別為：基礎(chǔ)組7只，假手術(shù)3周組8只，假手術(shù)6周組10只，假手術(shù)12周組9只，假手術(shù)24周組8只，去卵巢3周組8只，去卵巢6周組7只，去卵巢12周組9只，去卵巢24周組10只，共計(jì)76只。

1.3 血清ALP水平的檢測(cè)

基礎(chǔ)組大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后處死，其他大鼠分別在手術(shù)后3、6、12和24周處死。處死前，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，分離血清。血清ALP水平的測(cè)定采用721E型分光光度計(jì)，實(shí)驗(yàn)操作完全按照試劑盒說(shuō)明書完成。此試劑盒僅適用于科研、實(shí)驗(yàn)室的人與動(dòng)物血清及組織勻漿樣本中的ALP水平檢測(cè)，不可用于臨床診斷，貨號(hào)A059-1。

1.4 全骨髓細(xì)胞ALP染色

大鼠腹主動(dòng)脈取血處死后，迅速游離子宮并稱重以確定手術(shù)的成功。游離右側(cè)股骨和脛骨，用咬骨鉗剪去股骨和脛骨兩端的骨骺，用裝有PBS的5毫升注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓液，1000 r/min，室溫離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS洗2次后，用細(xì)胞涂片離心機(jī)制備細(xì)胞涂片。細(xì)胞涂片用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS沖洗兩次，每次5min，滴加NBT/BCIP顯色液，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，流水沖洗后，用水溶性封片劑封片，然后照相。每組隨機(jī)取3只大鼠的3張骨髓細(xì)胞涂片，每張片子在高倍鏡下計(jì)數(shù)6個(gè)視野中ALP陽(yáng)性染色的細(xì)胞的數(shù)目，每組累計(jì)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重的動(dòng)態(tài)變化

由圖1可知，與基礎(chǔ)組比較，假手術(shù)3周組體重?zé)o顯著變化(P<0.05)，去卵巢3周組體重顯著增加(P<0.05)；在手術(shù)3周后，假手術(shù)和去卵巢組大鼠體重隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均連續(xù)顯著增加；從手術(shù)后3周開(kāi)始，去卵巢組大鼠體重均顯著高于假手術(shù)組大鼠(P<0.05)，并在12周時(shí)出現(xiàn)極顯著差異(P<0.05)。

注：與0周4組比較：a，P﹤0.05；與3周組比較：b，P﹤0.05；與6周組比較：c，P﹤0.05；與12周組比較：d，P﹤0.05；與假手術(shù)組比較：e，P﹤0.05。

2.2 大鼠血清ALP水平的動(dòng)態(tài)變化

由圖2可知，在假手術(shù)組大鼠中，手術(shù)后3周血清ALP水平顯著上升(P<0.05)并持續(xù)到手術(shù)后6周，但手術(shù)后12周血清ALP水平卻顯著下降(P<0.05)并持續(xù)到手術(shù)后24周；在去卵巢組大鼠中，手術(shù)后3周血清ALP水平顯著上升(P<0.05)，但手術(shù)后6周血清ALP水平顯著下降(P<0.05)并持續(xù)到手術(shù)后24周(P<0.05)；從手術(shù)后3周開(kāi)始，去卵巢組大鼠血清ALP水平均顯著高于假手術(shù)組大鼠(P<0.05)，并在3周、12周時(shí)出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

注：與0周組比較：a，P<0.05；與3周組比較：b，P<0.05；與6周組比較：c，P<0.05；與12周組比較：d，P<0.05；與假手術(shù)組比較：e，P<0.05。

2.3 大鼠骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化

由圖3(彩插4)和表1可知，在假手術(shù)組大鼠中，手術(shù)后3周骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)并持續(xù)到手術(shù)后12周，但在手術(shù)后24周卻顯著下降(P<0.05)；在去卵巢組大鼠中，手術(shù)后3周骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目顯著下降(P<0.05)并持續(xù)到手術(shù)后24周；從手術(shù)后三周開(kāi)始，去卵巢組大鼠骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目均顯著低于假手術(shù)組大鼠(P<0.05)。

表1 各組大鼠骨髓細(xì)胞ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目的比較/每500個(gè)

3 討論

假手術(shù)3周后，大鼠體重與基礎(chǔ)組比較無(wú)顯著變化，在6周后顯著增加并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。提示，大鼠體重隨增齡而增加，但手術(shù)可短暫阻止大鼠體重的增加。在去卵巢組中，手術(shù)后3周體重就顯著高于0周組，其隨增齡上升的趨勢(shì)一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。提示，盡管有去卵巢手術(shù)的影響，但也抑制不了因缺乏雌激素而導(dǎo)致的體重上升。此外，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，去卵巢組大鼠體重始終顯著高于假手術(shù)組，此結(jié)果與Carey等人的報(bào)道結(jié)果相似[5]。

血清ALP是一種同工酶糖蛋白，主要來(lái)源自肝臟和骨骼，其中來(lái)源于骨骼的占40%～75%，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生。血清ALP活性測(cè)定主要用于診斷肝膽和骨骼系統(tǒng)疾病，臨床上除肝臟疾患、妊娠等因素外，血清ALP還可反映成骨情況。在骨代謝旺盛時(shí)，成骨細(xì)胞活躍，ALP分泌量增加，并存在于成骨細(xì)胞的周圍及其表面，極易釋入血中，使血清ALP活性上升。因此，血清ALP可作為骨重建活躍性改變的標(biāo)志之一[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠血清ALP水平呈先升高后下降的趨勢(shì)，即在手術(shù)后3周出現(xiàn)顯著上升并維持到6周，但在手術(shù)后12周出現(xiàn)顯著下降。提示，增齡能導(dǎo)致大鼠血清ALP水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，在峰值保持一段時(shí)間后隨著最大生育日齡的迫近而出現(xiàn)下降。去卵巢大鼠血清ALP水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在手術(shù)后3周出現(xiàn)顯著上升，在手術(shù)后6周出現(xiàn)顯著下降并持續(xù)在到手術(shù)后24周。該結(jié)果與于志鋒等[10]報(bào)道的結(jié)果基本上吻合，即大鼠去卵巢后，血清ALP出現(xiàn)較大幅度的波動(dòng)性變化，表現(xiàn)為先升、后降、再升并保持平穩(wěn)狀態(tài)。提示，大鼠在去卵巢手術(shù)后早期，由于骨轉(zhuǎn)換加快，破骨分化加劇，代償性地引起成骨分化加劇，骨骼中的ALP釋放到血液導(dǎo)致血清ALP顯著上升，而增齡到24周時(shí)，血清ALP水平較12周，又顯著下降，說(shuō)明大鼠骨骼的成骨分化減弱，已產(chǎn)生大規(guī)模的骨量丟失，骨質(zhì)疏松癥完全形成。比較假手術(shù)組和去卵巢組大鼠，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠血清ALP變化趨勢(shì)雖然相似，但去卵巢組大鼠血清ALP水平始終高于假手術(shù)組，且變化幅度較大。提示，去卵巢組大鼠的骨轉(zhuǎn)換明顯快于假手術(shù)組，這可能是造成去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的主要原因。

雖然血清ALP是一項(xiàng)衡量骨代謝水平的重要生化指標(biāo)，測(cè)試簡(jiǎn)便的同時(shí)還可以在保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存的情況下進(jìn)行取材檢測(cè)，但是骨髓ALP比血清ALP更具有代表性，更能直接顯示成骨分化的狀況[11]。因此，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究一致認(rèn)為，骨髓ALP水平是反映骨轉(zhuǎn)換過(guò)程更特異、更準(zhǔn)確、更靈敏的指標(biāo)。為此，本研究鏡下統(tǒng)計(jì)了大鼠全骨髓細(xì)胞中ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠骨髓ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目呈先上升后下降的趨勢(shì)，即在手術(shù)后3周出現(xiàn)顯著上升，在手術(shù)后24周出現(xiàn)顯著下降,變化趨勢(shì)與假手術(shù)大鼠血清ALP動(dòng)態(tài)變化相似。提示，假手術(shù)組大鼠血清ALP水平可間接反應(yīng)骨髓細(xì)胞ALP的變化趨勢(shì)。其科學(xué)意義在于可以預(yù)示用正常人群血清ALP水平間接反映其骨髓細(xì)胞骨代謝的情況。本實(shí)驗(yàn)中，去卵巢組大鼠骨髓ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目呈階梯式下降趨勢(shì)，即在手術(shù)后3周出現(xiàn)顯著下降，在手術(shù)后24周再次出現(xiàn)顯著下降，變化趨勢(shì)與去卵巢組大鼠血清ALP動(dòng)態(tài)變化不同。提示，大鼠去卵巢后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力下降，成骨能力減弱，同時(shí)，在去卵巢手術(shù)后早期由代償性成骨分化引起的ALP分泌上升可能迅速釋放入血液，并未積聚在骨髓中。此外，自手術(shù)后3周開(kāi)始，去卵巢組大鼠骨髓ALP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目始終顯著低于假手術(shù)組。提示，去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化能力的減弱有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠血清和骨髓細(xì)胞ALP水平變化趨勢(shì)基本相似，但去卵巢大鼠血清和骨髓細(xì)胞ALP水平變化趨勢(shì)不同。 提示，去卵巢能導(dǎo)致大鼠全骨髓細(xì)胞ALP水平的改變，即成骨分化能力的改變。

(本文圖3見(jiàn)彩插4。)

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