史深，姚剛，岳城，白莉，廖力夫，徐藝玫，張燕，丁瑩，燕順生

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052； 2.新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動物研究中心,烏魯木齊 830002)

近年來新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心一直致力于灰倉鼠(Cricetulusmigratorius)等野生嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn)動物化研究，結(jié)果表明灰倉鼠在鼠疫菌分離，包蟲病動物模型等方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有其他實(shí)驗(yàn)動物，具有良好的應(yīng)用前景[1]。在對目前馴化飼養(yǎng)的灰倉鼠進(jìn)行體內(nèi)寄生蟲調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)普遍感染鞭毛蟲(Tritrichomonassp)。實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1-2001)規(guī)定：SPF級實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)不得攜帶鞭毛蟲及纖毛蟲[2]。該種鞭毛蟲的存在影響灰倉鼠作為一種新型實(shí)驗(yàn)動物，SPF級種群的建立。明確此次分離到的鞭毛蟲生物學(xué)種屬，才能采取有效的手段對現(xiàn)有灰倉鼠進(jìn)行生物凈化，提高該品種實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量。本研究利用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對該鞭毛蟲的種屬進(jìn)行鑒定，為今后對灰倉鼠進(jìn)行生物凈化及制定灰倉鼠寄生蟲檢測等級標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鞭毛蟲的分離

鞭毛蟲蟲株分離自新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心馴化飼養(yǎng)的普通級灰倉鼠【SCXK(新) 2011-0002】回盲部，實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)實(shí)驗(yàn)在新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心動物實(shí)驗(yàn)基地【SYXK(新) 2011-0003】進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和主要試劑

光學(xué)顯微鏡(HSZ-H)；PCR 儀(BIO-RAD)；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)；瑞氏-姬姆薩染液；柱式DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 直接涂片法觀察

二氧化碳麻醉過量處死灰倉鼠，打開腹腔解剖回盲部，挑取適量內(nèi)容物置于載玻片，滴加適量生理鹽水稀釋，置于光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察。

1.3.2 瑞氏-姬姆薩染色法觀察

將稀釋100倍的混懸液涂片，自然干片后加入瑞氏-姬姆薩染液試劑盒中A液染色2 min后，加入2倍體積B液染色5 min，清水沖洗后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 鼠三毛滴蟲(Tritrichomonassp) 16s rRNA 基因的擴(kuò)增與序列分析

根據(jù)Cepicka I已發(fā)表的鼠三毛滴蟲16 SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物P1:5′-ACTTCTGTTCGTTCACTGT-3′；下游引物P2:5′-CCTTCCGTCAATTCCTTCA-3′(引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成)。柱式DNA提取試劑盒提取蟲體總DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：PCR master 12.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，基因組模板 2 μL，H2O 9 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。將PCR產(chǎn)物冰凍包裝郵寄至北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。

登陸NCBI BLAST進(jìn)行核酸同源性比較，應(yīng)用MEGA5.22軟件將測得序列與已報(bào)道的三毛滴蟲16S rRNA基因進(jìn)行對比分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察

用光學(xué)顯微鏡400倍觀察灰倉鼠回盲部內(nèi)容物涂片(圖1)，鏡下可見大量水滴形、梨形以轉(zhuǎn)圈方式游動的蟲體，蟲體游動活潑。光學(xué)顯微鏡1000倍觀察可見由前向后呈波浪狀運(yùn)動的波動膜(圖2)。以戊二醛固定蟲體后進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色(圖3)，置于光學(xué)顯微鏡1000倍可見蟲體生出3根前鞭毛，測量蟲體長度平均為18 μm，寬度平均為10 μm。(圖1～3見彩插8)。

2.2 基因測序結(jié)果與序列分析

應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物體外擴(kuò)增Tritrichomonasmuris的部分16S rRNA，擴(kuò)增出的片段約為378 bp(見圖4)，與預(yù)期的擴(kuò)增片段相符。

圖4 鼠三毛滴蟲新疆灰倉鼠株基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

部分16S rRNA 基因的測序結(jié)果：

ACTCAGCGCA GTATGATATC TTTACTTCTA GTAAAATCAA TGAGAGCCAC 50

CGGGGGTAGA TCTATTTCAT GGCGAACGGT GGAATGTTTT GACCCATGAG 100

AGAGAAACGA AGGCGAAAGC ATCTACCTAG AGGGTTTCTG TCGATCAAGG 150

GCGAGAGTAG GAGTATCCAA CCGGATCAGA GACCCGGGTA GTTCCTACCT 200

TAAACGATGC CGACAGGGGC TTGTCCTTTC ATGAGGGCAG GACCTTAGGA 250

GAAATCATAG TTCTTGGGCT CTGGGGGAAC TACGACCGCA AGGCTGAAAC 300

TTGAAGGATT TGA 313

以上基因序列通過NCBI BLAST進(jìn)行核酸同源性比較，結(jié)果與已報(bào)道的鼠三毛滴蟲(T.muris)(AY886846.1)的核酸序列具有高度同源性，同源性為99%。

測得序列使用MEGA5.2軟件與已報(bào)道的相關(guān)三毛滴蟲16S rRNA基因?qū)Ρ确治隼L制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)，結(jié)果表明灰倉鼠體內(nèi)鼠三毛滴蟲16S rRNA基因與已報(bào)道的鼠三毛滴蟲16S rRNA(AY886846.1) 位于同一進(jìn)化分支，與其他相關(guān)三毛滴蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖5 鼠三毛滴蟲新疆灰倉鼠株與已報(bào)道其他三毛滴蟲16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

鼠三毛滴蟲是一種常見于開放環(huán)境飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)大、小鼠和野生嚙齒類動物回盲部的非致病原蟲類寄生蟲[3]。研究表明三毛滴蟲主要通過被糞便或飲水經(jīng)口感染[4]。近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)對鼠三毛滴蟲鮮有報(bào)道，原因主要有：①實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量普遍提高，實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)早已淘汰普通級大小鼠。②鼠三毛滴蟲為非致病原蟲，對宿主危害性小于其他三毛滴蟲，如：牛胎兒三毛滴蟲(T.foetus)和豬三毛滴蟲(T.suis)[5]。此次灰倉鼠體內(nèi)分離到的鞭毛蟲通過形態(tài)學(xué)觀察對應(yīng)參照《實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠腸道鞭毛蟲檢索表》[6]，蟲體呈梨形，有3根前鞭毛，軸柱與體表接觸處有著色環(huán)，軸柱在體外部分變得尖細(xì)，波動膜和肋發(fā)育良好，屬于三毛滴蟲屬；此外通過對該鞭毛蟲寄生部位、運(yùn)動形式及大小等方面的系統(tǒng)分析初步確定該鞭毛蟲為鼠三毛滴蟲。該蟲株16S rRNA測序結(jié)果與已報(bào)道的其他三毛滴蟲(除T.muris(AY886846.1)外)親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，提示鼠三毛滴蟲可能具備一些自身特點(diǎn)，有待今后進(jìn)一步研究。

(本文圖1～3見彩插8)。

[1] Liao LF.Study of grey hamsterCricetulusmigratoriusas an experimental animal [J].Chin J Lab Anim Sci.2002,12:183-185.

[2] 國家技術(shù)監(jiān)督局.實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測 [S].GB 14922.1-2001．

[3] 陳德威.嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物疾病學(xué) [M].北京: 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1993.

[4] 王鉅,王曉輝,盧靜.普通環(huán)境和清潔級環(huán)境中長爪沙鼠寄生蟲感染狀況觀察 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(3):132-134.

[5] 李建華,韓紅衛(wèi),宮鵬濤.豬三毛滴蟲長春株的形態(tài)觀察及其5.8S rRNA基因分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(02):121-124.

[6] 高誠,符杰,王勝昌.實(shí)驗(yàn)大鼠、實(shí)驗(yàn)小鼠腸道鞭毛蟲種類和檢索 [J]．中國獸醫(yī)寄生蟲病,2000，8(2):9-11.