侯俊，劉澤，謝國明，羅聲棟，李瑞生，白冰珂

(1.解放軍第302醫(yī)院實驗技術(shù)研究保障中心,北京 100039；

2.解放軍第302醫(yī)院肝臟腫瘤診療與研究中心,北京 100039)

2003年我中心從SARS患者標(biāo)本中分離到1株新型呼腸病毒R4株[1]，這是繼1982年國內(nèi)報道分離出呼腸病毒21年后再次分離得到的呼腸病毒[2]。呼腸病毒是一種分節(jié)段病毒[3]，基因組由10個基因節(jié)段組成，分為3組，即3個大基因節(jié)段(L1，L2，L3)、3個中基因節(jié)段(M1，M2，M3)和4個小基因節(jié)段(S1，S2，S3，S4)。其中S1基因編碼σ1和σ1s蛋白，是呼腸病毒主要的抗原蛋白，能誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體和血凝抑制抗性，是決定病毒的致病性、感染性和毒力的主要因素。S2和S3基因分別編碼內(nèi)衣殼蛋白σ2和非結(jié)構(gòu)蛋白σNS，與病毒感染復(fù)制過程中結(jié)合dsRNA有關(guān)。S4基因編碼外衣殼蛋白σ3，對蛋白酶降解作用敏感。DNA疫苗由于不存在毒力回升、免疫應(yīng)答持久、制備簡單等特點，所以在病毒流行期的預(yù)防和控制等方面起到非常關(guān)鍵性的作用。為了從新型呼腸病毒4個小基因節(jié)段中篩選出制備疫苗最佳的備選片段，研制更有效的疫苗來預(yù)防和控制新型呼腸病毒所引起的疾病。因此，本實驗構(gòu)建了4種包含不同S基因節(jié)段的重組質(zhì)粒來免疫BALB/c小鼠，對其誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了對比分析，以期篩選出最佳的免疫片段，為今后疫苗的研發(fā)和應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

新型呼腸病毒R4株從北京第一例SARS患者咽拭子感染Hep-2細(xì)胞中分離。按照操作說明用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，一步法RT-PCR分別擴(kuò)增呼腸病毒小節(jié)段基因S1、S2、S3和S4片段，并分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)后，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCS1、pCS2、pCS3和 pCS4。酶切和測序分析確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒用Qiagen Plasmid Mega Kit (Cat.No.12181)大量純化并在SmartSpecTM Plus Spectrophotometer (Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上測定濃度和純度。取符合純度要求的質(zhì)粒DNA，根據(jù)其初始濃度稀釋至終濃度為1 μg/μL，置-40℃冰箱分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫小鼠

SPF級6～8周齡的BALB/c小鼠36只，雌性，體重18～20 g，來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0004】，實驗在解放軍第302醫(yī)院動物實驗室完成【SYXK(軍)2012-0010】。小鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。實驗I組，免疫pCS1質(zhì)粒，每只100 μg；實驗II組，免疫pCS2質(zhì)粒，每只100 μg；實驗Ⅲ組，免疫pCS3質(zhì)粒，每只100 μg；實驗IV組，免疫pCS4質(zhì)粒，每只100 μg；實驗V組，免疫pcDNA-3.1質(zhì)粒，每只100 μg；實驗Ⅵ組為PBS組，每只100 μL。隔2周用相同劑量重組質(zhì)粒加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。

1.3 免疫小鼠血清特異性抗體鑒定

每周小鼠尾靜脈采血，分離血清凍存?zhèn)溆谩Ｌ禺愋钥筊4抗體的檢測采用間接ELISA法。滅活R4病毒包被96孔板，每孔200 ng，4℃過夜。封閉后加入1∶10稀釋的血清，37℃孵育1h，每個血清樣品重復(fù)3個復(fù)孔。羊抗鼠二抗孵育并顯色后測定405 nm的光吸收值。

1.4 抗體亞型測定

IgG抗體亞型IgG1、IgG2a和IgG2b的測定分別用ADI公司ELISA檢測試劑盒(Catalog numbers 6330,6340,and 6350; Alpha Diagnostic International Inc.,USA)。按照說明書的要求，標(biāo)準(zhǔn)品、對照和待測血清樣品分別稀釋后加入孔中，37℃孵育1h。再經(jīng)過二抗孵育和底物顯色后，測定450 nm的光吸收值。

1.5 ELISPOT檢測

第3次免疫后10 d，摘眼球放血處死小鼠，取小鼠脾臟磨碎，分離淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液配成2×106/mL單細(xì)胞懸液，于96孔板中每孔加入100 μL。(96孔板預(yù)先每孔加入100 μL濃度為5 μg/mL的大鼠抗小鼠INF-γ抗體，4℃過夜進(jìn)行預(yù)包被。)每個基因?qū)?yīng)的特異性肽段作為刺激抗原加入孔中與淋巴細(xì)胞37℃共同孵育18 h。按照操作說明進(jìn)行二抗孵育和底物顯色后，送ELISPOT讀板儀進(jìn)行讀數(shù)(斑點形成細(xì)胞，SFC)。

2 結(jié)果

2.1 S基因免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)

血清1∶10稀釋后進(jìn)行ELISA檢測，與對照組相比，4個重組質(zhì)粒免疫的小鼠血清都有明顯的R4特異性抗體升高，其中S3免疫組的抗體水平最高。S1和S3組的抗體水平隨著免疫次數(shù)增多而逐步加強(qiáng)，呈持續(xù)升高。而S4組的抗體在第5周達(dá)到最高，第6周時抗體水平明顯回落。S2組抗體在前4周時抗體上升最快，而后大幅度下降，末次免疫后抗體水平最低(圖1，彩插1)。

2.2 IgG抗體亞型測定

對不同免疫小鼠血清的抗體亞型進(jìn)行了檢測，結(jié)果除了S3和S4免疫組之間的IgG2b水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)，4個重組質(zhì)粒免疫組和2個對照組之間的IgG2a、IgG2b和IgG1抗體水平都有明顯差異(P< 0.001)。S1、S2和S3免疫組的抗體以IgG2a占優(yōu)勢，而且S1免疫組的IgG2a抗體水平是IgG2b的3倍，是IgG1的將近10倍(圖2，彩插1)。

2.3 S基因免疫小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)

利用ELISPOT的方法檢測了不同免疫組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的INF-γ分泌情況。所有重組質(zhì)粒免疫組中分泌INF-γ的淋巴細(xì)胞比對照組至少有6倍提高(P< 0.001)，而且S1免疫組的孔中斑點數(shù)最多(在每10萬細(xì)胞中有350個斑點)，是S2組(在每10萬細(xì)胞中有111個斑點)的3倍，S3組(在每10萬細(xì)胞中有158個斑點)的2倍，S4組(在每10萬細(xì)胞中有56個斑點)的將近7倍(圖3)。

圖3 INF-γ特異性淋巴細(xì)胞分泌檢測

3 討論

呼腸病毒廣泛存在于自然界中，可從許多動物體內(nèi)(如蝙蝠和昆蟲)分離到[4]，加之感染后常無癥狀，與人類疾病的關(guān)系仍未確定；但有報道認(rèn)為呼腸病毒與人類某些疾病有關(guān)，如Rosen等[5]報道從患有輕度呼吸道和胃腸道疾病的兒童患者中分離出該病毒，而呼腸病毒1型曾引起爆發(fā)流行。王吉等[6]利用RT-PCR的方法分析了呼腸孤病毒Ⅲ型。劉偉等[7]構(gòu)建了小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒的載體，為病毒免疫原性的研究提供了參考。單純皰疹病毒的糖蛋白D特異性單克隆抗體IgG2a在保護(hù)小鼠免受病毒攻擊時就遠(yuǎn)比IgG1重要[8]。

該病毒的S1基因與原有的哺乳類呼腸病毒1、2、3型標(biāo)準(zhǔn)株差異較大，其氨基酸序列與目前已知呼腸病毒的同源性最高只有64%。呼腸病毒S1基因節(jié)段編碼σ1蛋白，是病毒主要的型特異中和抗原，決定病毒的感染力和致病性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。S1重組質(zhì)粒免疫后可產(chǎn)生以IgG2a占絕對優(yōu)勢的抗體，這與Nguyen等的研究結(jié)果基本一致[9]。如果采用病毒的蛋白或肽段作為疫苗去免疫小鼠，則主要產(chǎn)生以IgG1為主的抗體[10]。對于不同的免疫途徑或免疫佐劑也會影響DNA疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)，引發(fā)不同的抗體反應(yīng)[11]。Th1型細(xì)胞功能與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)，可引發(fā)嗜菌細(xì)胞介導(dǎo)的預(yù)防感染反應(yīng)，以MHV-3感染來說，Th1/Th2淋巴細(xì)胞有不同的作用[12]。高滴度的抗體僅能保護(hù)初次感染，卻并不能消除再次感染，僅僅有體液免疫反應(yīng)對于清除病毒感染是不夠的，Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)對于保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊起到至關(guān)重要的作用。而動物模型是疫苗評價的重要手段，朱華[13]和魏東[14]等利用小鼠建立了H7N9 禽流感病毒和H9N2亞型豬流感病毒的動物模型為其疫苗的評價提供了良好的研究平臺。

本實驗所構(gòu)建的4種包含不同S基因節(jié)段的重組質(zhì)粒免疫小鼠，其體液免疫反應(yīng)與對照組相比，4個重組質(zhì)粒免疫的小鼠血清都有明顯的R4特異性抗體升高，其中S3免疫組的抗體水平最高。S1和S3組的抗體水平隨著免疫次數(shù)增多而逐步加強(qiáng)，呈持續(xù)升高。S1，S2和S3免疫組的抗體以IgG2a亞型為主，是IgG2b的3倍，IgG1的10倍。細(xì)胞免疫反應(yīng)中免疫組分泌大量的INF-γ淋巴細(xì)胞，比對照組至少提高了6倍；孔中斑點數(shù)是S2組的3倍、S3組的2倍、S4組的7倍，這表明S1基因的重組質(zhì)粒引發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答最強(qiáng)。綜合血清抗體的檢測結(jié)果，S1基因的重組質(zhì)粒免疫小鼠可引發(fā)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要以IgG2a占優(yōu)勢的抗體反應(yīng)，是較為理想的疫苗選擇對象。溫璟[15]和丘力功等[16]利用OK432-腫瘤疫苗和電脈沖增強(qiáng)治療型HBV DNA疫苗評價了機(jī)體免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)，為疫苗的評價提供了參考。因此，本研究從新型呼腸病毒S基因中成功地篩選出S1基因是構(gòu)建DNA疫苗最佳的免疫片段，為今后研發(fā)和應(yīng)用S1基因重組DNA疫苗提供了可靠的理論依據(jù)。

(本文圖1、2見彩插1)。

[1] Duan Q,Zhu H,Yang L,et al.Reovirus,isolated from SARS patients [J].Chin Sci Bull,2003,48(13):1293-1296.

[2] 吳慎,李印堂,吳士芳,等.兩株呼腸病毒的分離和鑒定 [J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1982,62(3):146-151.

[3] Kim M,Chung YH,Johnston RN.Reovirus and tumor oncolysis [J].J Microbiol,2007,45(3):187-192.

[4] Chua KB,Crameri G,Hyatt A,et al.A previously unknown reovirus of bat origin is associated with an acute respiratory disease in humans [J].Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104(27):11424-11429.

[5] Rosen L,Evans HE,Spickard A.Reovirus infections in human volunteers [J].Am J Epidemiol,1963,77:29-37.

[6] 王吉,衛(wèi)禮,賀爭鳴,等.呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測方法的建立 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(9):46-50.

[7] 劉偉,余英豪.重組表達(dá)小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(1):54-61.

[8] Ishizaka ST,Piacente P,Silva J,et al.IgG subtype is correlated with efficiency of passive protection and effector function of anti-herpes simplex virus glycoprotein D monoclonal antibodies [J].J Infect Dis.1995,172(4):1108-1111.

[9] Nguyen L,Knipe DM,Finberg RW.Mechanism of virus-induced Ig subclass shifts [J].J Immunol.1994,152(2):478-484.

[10] Stasikova J,Kutinova L,Smahel M,et al.Immunization with varicella-zoster virus glycoprotein E expressing vectors: comparison of antibody response to DNA vaccine and recombinant vaccinia virus [J].Acta Virol.2003,47(1):1-10.

[11] Song L,Zhou Y,He J,et al.Comparative sequence analyses of a new mammalian reovirus genome and the mammalian reovirus S1 genes from six new serotype 2 human isolates [J].Virus Genes.2008,37(3):392-399.

[12] Whitmire JK,Benning N,Whitton JL.Cutting edge: early IFN-gamma signaling directly enhances primary antiviral CD4+T cell responses [J].J Immunol.2005,175(9): 5624-5628.

[13] 朱華,許黎黎,鮑琳琳,等.H7N9 禽流感病毒小鼠感染動物模型的建立 [J].中國實驗動物學(xué)報,2014,22(1):18-21.

[14] 魏東,劉英,徐彤.H9N2亞型豬流感病毒感染BALB/c小鼠動物模型的建立 [J].中國實驗動物學(xué)報,2012,20(5):54-57 +98.

[15] 溫璟,鄭曉東,武峰,等.OK432-腫瘤疫苗對DBA/2小鼠外周血中T細(xì)胞亞群的影響 [J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(11):16-18.

[16] 丘力功,孫希海,韋劍,等.利用體內(nèi)電脈沖增強(qiáng)治療型HBV DNA疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究 [J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,7(11):23-26.