史同瑞，劉 宇，王 爽，王 巖，朱丹丹，李 丹

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006）

發(fā)酵是中藥炮制的一種重要方法，近年來(lái)，有關(guān)應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)酵中藥的研究越來(lái)越多，本文綜述了現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)的概況及其優(yōu)勢(shì)。

微生物具有強(qiáng)大的分解和轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，并可產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，發(fā)酵中藥作為中藥一種炮制加工工藝已具有悠久的歷史。發(fā)酵中藥是利用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥，其工藝反應(yīng)條件溫和，中藥制劑高效、低毒、低殘留。傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵僅是利用自然界的自然菌種進(jìn)行發(fā)酵，菌種不純，且操作方法原始粗放，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)力低下，不能利用現(xiàn)代研究成果定向改變藥物的性能，或有意識(shí)地根據(jù)藥物之間的特性進(jìn)行有目的的組合，因此，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥已成為中藥現(xiàn)代化的研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)，又稱(chēng)中藥生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，是在繼承傳統(tǒng)中藥發(fā)酵炮制方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代微生態(tài)學(xué)、生物工程學(xué)、發(fā)酵工程技術(shù)等學(xué)科，形成的中藥現(xiàn)代化制藥新技術(shù)?，F(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)的研究起步于20世紀(jì)80年代，當(dāng)時(shí)中藥發(fā)酵技術(shù)的研究多為單味中藥發(fā)酵，且主要集中在真菌自身發(fā)酵方面，如靈芝菌、冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。目前中藥發(fā)酵的研究已從單味藥發(fā)展到復(fù)方藥，且發(fā)酵中藥制劑能更大程度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用，擴(kuò)大適應(yīng)癥[1]。

1 中藥發(fā)酵分類(lèi)

中藥發(fā)酵技術(shù)是在繼承傳統(tǒng)中藥發(fā)酵炮制方法的基礎(chǔ)上，吸取現(xiàn)代生物技術(shù)而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的狀態(tài)，現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)分為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩類(lèi)。液體發(fā)酵，又稱(chēng)為液體深層發(fā)酵，是在借鑒抗生素生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，液體發(fā)酵是把菌絲體加入培養(yǎng)基與藥材混合物中，置適溫發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)品包括菌絲體和發(fā)酵液。液體發(fā)酵傳質(zhì)效率高，成本低，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，所以有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[2]。

固體發(fā)酵源自古代的制曲工藝，以富含營(yíng)養(yǎng)成分的農(nóng)副產(chǎn)品為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用一種或多種菌作為發(fā)酵菌種，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵。其發(fā)酵自然開(kāi)放，基質(zhì)不滅菌。雖然固體發(fā)酵制劑的效果并不亞于深層發(fā)酵，但其工藝存在一定的局限性，如機(jī)械化程度低，難以大規(guī)模生產(chǎn)，發(fā)酵速度慢，產(chǎn)量有限，且生產(chǎn)過(guò)程多依據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷，缺乏科學(xué)的發(fā)酵終點(diǎn)，以及與質(zhì)量控制指標(biāo)和合理的產(chǎn)品后處理工藝[3]。

20世紀(jì)80年代后期，莊毅等[4]建立了一種使真菌與中藥有機(jī)結(jié)合的復(fù)合型中藥生產(chǎn)工藝，稱(chēng)為新型固體發(fā)酵，也稱(chēng)雙向性固體發(fā)酵。新型固體發(fā)酵是采用具有一定活性成分的中藥或藥渣作為藥性基質(zhì)，替代傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)型基質(zhì)，與發(fā)酵菌種構(gòu)成發(fā)酵組合，具有活性成分的藥性基質(zhì)既能提供真菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大量生長(zhǎng)繁殖菌體，又能因真菌酶的影響而改變其原有組織成分，產(chǎn)生新的性味功能，因此它具有雙向性。

2 中藥發(fā)酵優(yōu)勢(shì)

2.1 保護(hù)中藥活性成分免受破壞

微生物發(fā)酵是在常溫、常壓等較為溫和的條件下進(jìn)行的生長(zhǎng)代謝和生物轉(zhuǎn)化，故能最大限度地保護(hù)中藥活性成分免遭破壞，特別是對(duì)熱敏感的芳香類(lèi)揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、微量元素等活性成分，如薄荷、當(dāng)歸等中藥，解決了中藥在煎、煮、熬、煉、蒸、浸等傳統(tǒng)加工工藝中,活性成分易于破壞的難題。吳志勇等[5]應(yīng)用生物工程技術(shù)發(fā)酵中藥黃芪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵黃芪所含黃芪多糖是普通煎、煮、熬水提法的5倍，等量黃芪發(fā)酵藥效約是一般煎、煮、熬水的28倍。

2.2 疊加發(fā)酵益生菌功能

微生態(tài)中藥制劑是根據(jù)中醫(yī)藥學(xué)、醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)等學(xué)科理論，在傳統(tǒng)中藥制劑的制備中，引入益生菌等有益微生物發(fā)酵中藥，并采用酶水解菌種培養(yǎng)基等現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)中藥制劑。由于正常微生態(tài)菌能夠參與機(jī)體的多種生理功能，如糖、氮質(zhì)、脂類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽代謝和維生素等物質(zhì)的合成，增強(qiáng)機(jī)體抗病力，同時(shí)還能提高機(jī)體對(duì)中藥的吸收和利用，因此應(yīng)用微生態(tài)菌發(fā)酵中藥，可集發(fā)酵中藥制劑和微生態(tài)制劑雙重功能，其臨床效果優(yōu)于常規(guī)微生物發(fā)酵制劑[6]。元紅梅等[7]隨機(jī)將86例高膽紅素血癥新生患兒分為兩組，治療組聯(lián)用微生態(tài)活菌制劑與中藥顆粒劑，基本處方為茵陳、梔子、大黃和甘草等，結(jié)果治療組的療效明顯優(yōu)于采用常規(guī)療法的對(duì)照組(P＜0.01)，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，微生態(tài)制劑與中藥聯(lián)合治療新生兒高膽紅素血癥，具有協(xié)同作用，且療效確切。

2.3 環(huán)保節(jié)能

應(yīng)用常規(guī)方法提取中藥有效成分后藥渣常被廢棄，不僅污染環(huán)境，也浪費(fèi)了中藥資源，而利用微生物發(fā)酵中藥，可使中藥充分釋放有效成分，提高其有效成分的含量，因此，在臨床用藥中可以減少中藥的使用量，節(jié)約中藥資源，實(shí)現(xiàn)既節(jié)能環(huán)保，又可廢物再用的目的。由于微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中能分泌一系列的酶，應(yīng)用微生物發(fā)酵中藥，能將中藥中的纖維素、木質(zhì)素類(lèi)等大分子物質(zhì)降解，同時(shí)也可將中藥轉(zhuǎn)化為菌體蛋白和多糖等，因此，發(fā)酵中藥均能被利用，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。王建芳[8]等利用香菇對(duì)中藥廢渣進(jìn)行固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明，無(wú)論是液態(tài)發(fā)酵，還是固態(tài)發(fā)酵，香菇發(fā)酵中藥廢渣均能提高粗蛋白和可溶性多糖含量，降低纖維素含量，使中藥廢渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯提高。

3 微生物在中藥發(fā)酵中的作用

3.1 提高中藥有效成分提取率

中草藥的有效成分大多包裹在中藥材的細(xì)胞壁內(nèi)。植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)。在中藥有效成分提取過(guò)程中，當(dāng)胞內(nèi)中的有效成分向提取介質(zhì)中擴(kuò)散時(shí)，需要克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻力。應(yīng)用微生物發(fā)酵中藥時(shí)，微生物可利用中藥成分作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和代謝，微生物代謝過(guò)程中分泌的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脂酶等胞外酶，使細(xì)胞破裂，從而利于中藥有效成分從胞內(nèi)釋放，使中藥有效組分、活性物質(zhì)最大限度地得以提取和利用。

3.2 降解中藥大分子物質(zhì)

中藥活性成分大多結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在發(fā)酵中藥過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)代謝具有強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，能將許多不能直接吸收利用的大分子有效活性物質(zhì)降解為小分子活性物質(zhì)，小分子活性物質(zhì)可通過(guò)血腦屏障，并與機(jī)體的細(xì)胞蛋白結(jié)合，從而易于機(jī)體對(duì)有效成分的吸收和利用，提高中藥的治療效果，因此，發(fā)酵中藥具有更高的生物活性[9]。陳永強(qiáng)[10]等研究發(fā)現(xiàn)，甘草經(jīng)微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶水解后，可將甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸，甘草次酸能被腸道直接吸收，短時(shí)間內(nèi)即可在血液中達(dá)到較高的藥物濃度，并迅速作用于靶部位，同時(shí)通過(guò)微生物的作用，甘草的細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞壁被分解，促進(jìn)了甘草其它有效成份的釋放。應(yīng)用效果證實(shí)，經(jīng)微生物發(fā)酵甘草的抗炎、鎮(zhèn)痛效果顯著增強(qiáng)。

3.3 產(chǎn)生新的活性物質(zhì)

在微生物發(fā)酵中藥過(guò)程中，中藥某些成分可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝及其活性成分的產(chǎn)生有促進(jìn)或抑制作用，而微生物在中藥特殊環(huán)境中也有可能改變自身的代謝途徑，在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生豐富的初生或次生代謝產(chǎn)物，有些代謝產(chǎn)物自身就是功效良好的藥物，此外，以中藥一些成分為前體，經(jīng)酯化、氧化、葡萄糖基化、異構(gòu)化、甲基化、去甲基化、乙?；榷喾N生物轉(zhuǎn)化途徑，可生成新的化合物[11]。李國(guó)紅等[12]應(yīng)用枯草芽孢桿菌對(duì)三七根進(jìn)行發(fā)酵，在對(duì)發(fā)酵中藥的皂苷成分研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵后的三七中分離出被微生物轉(zhuǎn)化的人參皂苷RH4。這種化合物在發(fā)酵前未被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明這種化合物是通過(guò)發(fā)酵新產(chǎn)生的，究其原因可能是在發(fā)酵過(guò)程中，三七須根的某些皂苷被微生物轉(zhuǎn)化為人參皂苷RH4。王玉紅等[13]在靈芝的發(fā)酵液中加入黃芪進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中多糖組分發(fā)生變化，推測(cè)有可能有新化合物產(chǎn)生。

3.4 降低中藥毒副作用

微生物的分解轉(zhuǎn)化作用有可能將中藥中的有毒成分，如生物堿類(lèi)、苷類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、蛋白類(lèi)、重金屬等成分進(jìn)行分解，或?qū)χ兴幱卸净钚猿煞诌M(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而降低中藥的毒副作用[14]。大黃生用時(shí)瀉下作用峻烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應(yīng)。大黃瀉下成分主要是結(jié)合型蒽醌衍生物，其中以二蒽醌番瀉苷作用最強(qiáng)。在中醫(yī)臨床中為緩和大黃的瀉下作用，以及對(duì)胃腸道的不良反應(yīng)，常用不同的炮制方法，將結(jié)合型蒽醌分解破壞，從而緩和瀉下作用和其它副作用。研究表明，用酵母菌發(fā)酵大黃，可以使大黃中等總蒽醌含量有所降低。結(jié)合型蒽醌含量降低，分離型蒽醌含量增加，可以起到減毒增效的作用[15]。王興紅等[16]研究證實(shí)，菜籽餅、棉籽餅經(jīng)微生物發(fā)酵后可以脫去有毒物質(zhì)。

4 中藥發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)

4.1 篩選適合發(fā)酵的中藥

中藥是發(fā)酵的基本物質(zhì)，發(fā)酵中藥包括單味中藥或復(fù)方中藥，篩選針對(duì)某一活性功能的發(fā)酵中藥材是開(kāi)發(fā)中藥發(fā)酵制劑的技術(shù)基礎(chǔ)。李國(guó)紅等[17]曾利用枯草芽孢桿菌對(duì)50味中藥進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物及原中草藥對(duì)結(jié)核分支桿菌和榛色青霉菌的抗菌活性。結(jié)果表明，連翹等中藥發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性出現(xiàn)增強(qiáng)，而苦參等中藥發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性則降低，其它中藥的活性未見(jiàn)變化，本試驗(yàn)說(shuō)明并非所有發(fā)酵中藥均能增加療效，研發(fā)發(fā)酵中藥制劑，應(yīng)選擇適合發(fā)酵，且能增加藥性的中藥。

4.2 選育優(yōu)良發(fā)酵菌種

選育優(yōu)良發(fā)酵菌種是發(fā)酵中藥的技術(shù)關(guān)鍵。微生物的生物多樣性為中藥發(fā)酵提供了豐富的可供選擇的菌種，不同微生物具有不同的生物特性，對(duì)中藥發(fā)酵可能產(chǎn)生不同的效果。真菌不僅具有種類(lèi)多、次生代謝產(chǎn)物多、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，而且還能產(chǎn)生分解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的酶類(lèi)，對(duì)天然培養(yǎng)基具有較強(qiáng)的分解利用能力，是發(fā)酵中藥的主要功能菌。

傳統(tǒng)中藥發(fā)酵多用自然菌，如中藥淡豆豉，目前發(fā)酵中藥多采用單一菌種純種發(fā)酵。除了在自然界分離篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的發(fā)酵菌種外，還可利用物理和化學(xué)誘變技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)進(jìn)行優(yōu)良菌種的選育[18]。蔡琨等[19]用純種細(xì)菌發(fā)酵淡豆豉，以染料木素和大豆黃素為指標(biāo)檢測(cè)主要發(fā)酵后的有效成分，結(jié)果證實(shí)，純種細(xì)菌發(fā)酵可以保證淡豆豉生產(chǎn)的穩(wěn)定性和產(chǎn)量的提高。

4.3 優(yōu)化中藥發(fā)酵條件

為了提高發(fā)酵菌種的轉(zhuǎn)化水平，獲得發(fā)酵中藥更多目的產(chǎn)物，應(yīng)加強(qiáng)培養(yǎng)基、溫度、濕度、發(fā)酵時(shí)間等條件的優(yōu)化，制定科學(xué)的發(fā)酵工藝。不同中藥木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量差異較大，只有篩選適宜菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度等工藝條件，才能確保發(fā)酵菌種最大限度地利用以中藥材為主要組分的培養(yǎng)基，釋放和產(chǎn)生更多的目標(biāo)物。沈維鐸等[20]應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)香菇液體培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用含馬鈴薯20%、葡萄糖2.0%、酵母粉2.0%、黃豆粉4.0%、木屑4.0%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.15%，pH5.5的培養(yǎng)基，當(dāng)液體培養(yǎng)基裝量為發(fā)酵容器70%，液體菌種接種量為培養(yǎng)基量的15%，在環(huán)境溫度25℃中，以150r/min攪拌速度發(fā)酵培養(yǎng)3d，該工藝生產(chǎn)的香菇菌絲產(chǎn)量最高。

4.4 活性成分與藥理模型篩選

中藥自身成分復(fù)雜，中藥的藥理作用是一個(gè)涉及多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用過(guò)程，同時(shí)加之中藥發(fā)酵微生物生長(zhǎng)特性的多樣性，中藥發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生許多化合物，從復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出有效成分是確定發(fā)酵中藥藥效的關(guān)鍵，而合理的藥理模型是發(fā)酵產(chǎn)物活性成分篩選，以及建立中藥多靶點(diǎn)作用模式的重要保障。徐萌萌等[21]研究表明，苷類(lèi)中藥需經(jīng)腸道中的微生物轉(zhuǎn)化為苷元后方能產(chǎn)生藥效。通過(guò)模仿腸道微生物轉(zhuǎn)化苷的過(guò)程，利用微生物體外發(fā)酵產(chǎn)生的酶系轉(zhuǎn)化苷類(lèi)中藥，建立苷類(lèi)中藥體外微生物轉(zhuǎn)化模型，在體外把原型藥物苷轉(zhuǎn)化為人體能迅速吸收的有效成分苷元，可有效提高活性成分的生物利用度。試驗(yàn)表明，建立體外模型將藥材中的苷類(lèi)成分轉(zhuǎn)化為中間體苷元，過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低，不但可以將中間體開(kāi)發(fā)為新劑型，而且也符合中藥炮制現(xiàn)代化的客觀要求。

迄今，眾多的研究已經(jīng)表明，發(fā)酵中藥是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的完美結(jié)合。利用微生物發(fā)酵中藥，能提高發(fā)酵中藥制劑活性成分等含量，增強(qiáng)療效，改變?cè)行阅?。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生物發(fā)酵中藥將具有更加廣闊的發(fā)展空間。

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