祝司霞

(攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花 617000)

自然界中，99.9%的細(xì)菌以生物膜形式存在[1]，細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)是細(xì)菌為適應(yīng)周圍環(huán)境而形成的自我保護(hù)形式，它是與游走細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的存在形式，絕大多數(shù)細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了精細(xì)的粘附機(jī)制，分泌基質(zhì)并相互粘連形成膜狀物附著于病灶表面，從而形成BF 的復(fù)雜團(tuán)體。BF 與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，它可以粘附在人體組織器官表面，而且對(duì)抗生素和機(jī)體免疫力的抵抗能力大大增強(qiáng)，通常引起諸如慢性支氣管炎、肺部感染、敗血癥、牙周病和心內(nèi)膜炎等難治疾?。欢褺F 還能牢固的粘附在醫(yī)用材料上（動(dòng)靜脈導(dǎo)管，氣管插管，導(dǎo)尿管，人工心臟瓣膜，人工關(guān)節(jié)等），導(dǎo)致醫(yī)源性感染的發(fā)生和相關(guān)治療的失??；此外，自來(lái)水管道、下水道、空調(diào)系統(tǒng)等與人類生活相關(guān)的設(shè)施也會(huì)污染BF 細(xì)菌，腐蝕工業(yè)管道，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，對(duì)BF 的研究已經(jīng)成了醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)當(dāng)中的熱點(diǎn)課題，下面對(duì)BF 的基本特性做一綜述，以期能對(duì)疾病的治療和環(huán)境的治理提供一定的理論依據(jù)。

1 生物膜的成份及其功能

BF 含有多種成分，其中水份含量可高達(dá)97%，此外，還含有細(xì)菌和細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多聚物、吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物、細(xì)菌裂解產(chǎn)物及環(huán)境中的特殊物質(zhì)或碎屑等，它們的成分是蛋白質(zhì)、多糖、核酸、肽聚糖、脂和磷脂等，約占BF 的2%～15%[3]。

BF 中的水或流動(dòng)或固著在膜中。BF 中可含有純種細(xì)菌，也可含有多種細(xì)菌，能分泌多種胞外物質(zhì)，幫助BF 的形成。胞外多聚物，包括胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)和糖蛋白，多糖隨細(xì)菌種類不同而不同，多高度分支，牢固地凝集在一起構(gòu)成BF 的支架，也可作為某些細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物，對(duì)BF 中細(xì)菌的存活非常重要。BF 中膜整合蛋白居多，具高度的親和性，能作為黏附劑。此外，還有調(diào)節(jié)蛋白，能調(diào)節(jié)某些特定基因表達(dá)，具有信號(hào)通路作用的信號(hào)分子和一些酶等功能蛋白。BF 中的代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素、維生素、抗生素和噬菌體等，它們是菌體釋放的，可以抵抗BF 外的其它異種菌群，或給細(xì)菌的生存提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。有學(xué)者認(rèn)為，BF 中的DNA 一部分是菌體死亡裂解被動(dòng)釋放的，作用不大；還有一部分是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段表達(dá)自溶素，促進(jìn)DNA 的主動(dòng)分泌，這些DNA 能促進(jìn)BF 的形成和穩(wěn)定BF；另外，BF 中細(xì)菌易建立感受態(tài)，可攝取胞外DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致遺傳性狀的改變[4]。

2 生物膜的結(jié)構(gòu)

目前，有兩種典型的BF 結(jié)構(gòu)模型：“異質(zhì)鑲嵌”模型，“蘑菇或郁金香”模型。“異質(zhì)鑲嵌”模型認(rèn)為，胞外多糖把眾多菌體聚集成許多的小疊狀體，疊狀體再聯(lián)結(jié)成柱狀物，外圍環(huán)繞液體層?！澳⒐交蛴艚鹣恪蹦Ｐ蛣t認(rèn)為，BF 中的細(xì)菌形成許多微菌落，膜頂比膜底寬，形似蘑菇或郁金香，微菌落之間有輸水通路，水溶液不斷的在通路中循環(huán)流動(dòng)，能夠輸送營(yíng)養(yǎng)和排出廢物等，這種結(jié)構(gòu)和功能類似原始的循環(huán)系統(tǒng)[5]。

有學(xué)者認(rèn)為，模型化的BF 從外向內(nèi)依次為：生物膜主體層(bulk of biofilm)、連接層(1inking film)、調(diào)節(jié)層(conditioning film)、基質(zhì)層(substratum)。它的主要特點(diǎn)是BF 的結(jié)構(gòu)存在著廣泛的異質(zhì)性，其深處和淺處的細(xì)菌體積大小和代謝活性均有顯著差異，如產(chǎn)生不同的毒素，原因是細(xì)菌所處的pH 值和氧化還原電位等微環(huán)境不同，導(dǎo)致相同的細(xì)菌其基因表達(dá)模式不同，在BF 垂直方向不同層面的細(xì)菌RNA含量、蛋白質(zhì)合成和呼吸活性均不同[6]。因此，不同細(xì)菌或同一細(xì)菌不同環(huán)境形成的BF 結(jié)構(gòu)差異較大，可因種類、營(yíng)養(yǎng)、附著的表面特性和環(huán)境條件不同形成疏松、致密或厚薄不等的BF 結(jié)構(gòu)。

3 生物膜的形成

細(xì)菌形成BF 是一種本能，是表面生活時(shí)的一種生長(zhǎng)方式，任何細(xì)菌在條件合適的情況下，都能形成BF，遺傳改變可影響其形成BF的能力。BF 的形成和發(fā)展過(guò)程經(jīng)歷以下5 個(gè)階段：

3.1 調(diào)節(jié)膜的形成

宿主提供BF 表面，是細(xì)菌在宿主體內(nèi)形成細(xì)菌BF 的第1 步。BF的形成大多與植入體內(nèi)的生物材料和自身組織病變有關(guān)。首先生物材料和自身病變組織提供BF 表面，隨后唾液、血液、尿液、胃腸道液等含有機(jī)（主要是多糖和蛋白質(zhì)）或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的體液會(huì)在幾分鐘之內(nèi)覆蓋其上，這些覆蓋于表面的體液形成一個(gè)2～10nm 的蛋白吸附層，叫做調(diào)節(jié)膜(CB)，而CB 表面的蛋白、糖蛋白、糖脂等作為特異受體可選擇性地與細(xì)菌黏附[3]，最后細(xì)菌附著其上。

3.2 菌體粘附

細(xì)菌黏附是細(xì)菌對(duì)宿主BF 表面的黏附和菌體間的聚集過(guò)程。黏附對(duì)細(xì)菌BF 的形成至關(guān)重要，細(xì)菌黏附于表面可免于被流體帶到不利于其生長(zhǎng)的環(huán)境，例如，尿道中的大腸桿菌，牢固地附著在尿道內(nèi)，免于被尿液沖出體外。最初細(xì)菌通過(guò)沉積、Brown 運(yùn)動(dòng)、經(jīng)液體流動(dòng)、細(xì)菌表面和調(diào)節(jié)膜間的靜電吸引等進(jìn)行可逆性的附著[7]。細(xì)菌還可以與機(jī)體組織、生物材料表面通過(guò)化學(xué)鍵發(fā)生受體和配體間特異性結(jié)合，因此黏附具有選擇性和特異性。宿主組織表面的蛋白、糖蛋白和糖脂?？勺鳛槭荏w，選擇性地吸附特定種類細(xì)菌表面特定的黏附素蛋白(adhesin)。

此階段細(xì)菌BF 尚未成熟，抵抗力不強(qiáng)，對(duì)各種抗菌藥物也相對(duì)敏感，抑菌或殺菌效果較好。

3.3 生物膜的發(fā)展

即眾多微菌落的形成過(guò)程，微小的菌落，是BF 的基本組成單位。一方面大量游動(dòng)菌體進(jìn)一步黏附于已固著的菌體表面，另一方面已固著菌體大量生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)菌體分泌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)顯著增加，胞外多聚物（EPS）的大量表達(dá)是細(xì)菌附著后最重要的生長(zhǎng)變化之一。這些多聚物提供了一個(gè)堅(jiān)固而有黏性的骨架，相互交叉成長(zhǎng)鏈，將細(xì)胞固定在一起，賦予生物膜以剛性與柔韌性。EPS 把細(xì)菌粘結(jié)成細(xì)菌團(tuán)塊，即微菌落(microcolony)。大量微菌落使BF 加厚[8，9]。此過(guò)程中，細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而產(chǎn)生一些新的特性，如BF 中細(xì)菌對(duì)抗生素抗性顯著提高，給臨床治療帶來(lái)一定的困難。

3.4 生物膜的成熟

即眾多微菌落連接成大的擴(kuò)散性結(jié)構(gòu)的過(guò)程。當(dāng)微菌落擴(kuò)大到一定程度，BF 就進(jìn)入了成熟階段。大量微菌落使細(xì)菌BF 加厚，細(xì)菌BF趨于成熟。

此過(guò)程細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞間黏附素（主要是胞外多糖）自我聚集，同時(shí)需要多種遺傳因子參與，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)菌體表面存在帶有“接觸感受器”的特定“興奮區(qū)”，能對(duì)其所接觸的物質(zhì)表面進(jìn)行檢測(cè)、作出應(yīng)答，啟動(dòng)特定基因的表達(dá)[9]。另外，細(xì)菌附著于表面后，進(jìn)行生長(zhǎng)、分裂、繁殖，其他游走細(xì)胞繼續(xù)附著，最終導(dǎo)致該附著位點(diǎn)的細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境極度擁擠，有毒代謝產(chǎn)物積累，許多細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，在這種競(jìng)爭(zhēng)壓力下，細(xì)菌啟動(dòng)胞間信號(hào)系統(tǒng)，產(chǎn)生胞間信號(hào)。目前學(xué)術(shù)界比較認(rèn)可的是在細(xì)菌BF 的形成和成熟中有一種信息交流系統(tǒng)，其中密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorom sensing，QS)起著重要作用，QS 能根據(jù)自身所處環(huán)境或群體密度的變化來(lái)調(diào)節(jié)多種靶基因表達(dá)，如細(xì)菌密度改變或營(yíng)養(yǎng)條件變化時(shí)，細(xì)菌表面產(chǎn)生和分泌某種特定信號(hào)分子，一般稱為信息激素或自身誘導(dǎo)素，與調(diào)控蛋白(主動(dòng)誘導(dǎo)子)或外激素結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，這種復(fù)合物再與胞內(nèi)特定的靶基因結(jié)合，從而激活或抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。這種機(jī)制能有效的促使菌體檢測(cè)其自身種群的密度變化，避免細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)而造成空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏[10]。目前已知有5類信息激素：?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl homoserine，AHI)、PQSs(heptylhydroxy，庚基羥基)、AL2、循環(huán)二肽(cyclic dipeptide)和寡肽(oligopeptide)[11，15]。其中高絲氨酸內(nèi)酯是一種重要的生物膜內(nèi)的信號(hào)傳遞分子，高絲氨酸內(nèi)酯能促進(jìn)BF 的三維空間結(jié)構(gòu)的形成和維持，不產(chǎn)高絲氨酸內(nèi)酯的缺陷型菌株緊緊包裹在一起的細(xì)胞，極易被十二烷基硫酸鈉所破壞。

3.5 細(xì)菌播散

在內(nèi)在的調(diào)節(jié)機(jī)制或在外部沖刷力等作用下，成熟的BF 中的部分細(xì)菌能從BF 脫離，如通過(guò)外力、波狀遷移的物理運(yùn)動(dòng)、或者自我消解播散到其他環(huán)境，引起感染。細(xì)菌從BF 內(nèi)游離出來(lái)，轉(zhuǎn)變成浮游狀態(tài)，尋求更適宜的生存環(huán)境，再黏附到合適的介質(zhì)表面形成新的BF，形成游走細(xì)胞-細(xì)菌BF-游走細(xì)胞-細(xì)菌BF 的循環(huán)往復(fù)。有人研究，大腸埃希菌的BF 中，RNA 連接蛋白CsrA 是BF 分解的始動(dòng)因子[12]。

4 生物膜的特點(diǎn)

4.1 移動(dòng)性

BF 中的細(xì)菌大部分都固著于多聚物基質(zhì)中，少數(shù)可自由移動(dòng)，從膜中一個(gè)微菌落移動(dòng)到另一個(gè)微菌落，也可脫離BF 進(jìn)一步擴(kuò)散，這種擴(kuò)散可能是BF 對(duì)環(huán)境變化作出應(yīng)答的結(jié)果[12]。如當(dāng)細(xì)菌處于饑餓或其他不利條件下，細(xì)菌能分泌胞外多糖水解酶，水解胞外多糖，從BF 內(nèi)游離出來(lái)，轉(zhuǎn)變成浮游狀態(tài)。

4.2 異質(zhì)性

BF 深處和淺處的細(xì)菌體積大小和代謝活性均有顯著差異，表明其結(jié)構(gòu)存在著廣泛的異質(zhì)性[10]。BF 的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，由于BF中的細(xì)菌在不同時(shí)間和空間發(fā)展，擴(kuò)大了細(xì)菌的生存環(huán)境，造成其基因表達(dá)和生理活性上的不均質(zhì)性，BF 不同層面的細(xì)菌RNA 含量、呼吸活性和蛋白質(zhì)合成均不同；同時(shí)遺傳學(xué)上一致的細(xì)菌由于細(xì)菌所處微環(huán)境的pH 值和氧化還原電位等不同，可誘導(dǎo)其表達(dá)與浮游細(xì)菌不同的基因，常導(dǎo)致生理狀態(tài)發(fā)生顯著變化。處于BF 深層的細(xì)菌很難獲得養(yǎng)分和氧氣，代謝活性很低，而淺層的細(xì)菌則相反。因此，不均質(zhì)性是細(xì)菌BF 的另一個(gè)重要特性，也與細(xì)菌的抗性有關(guān)。

4.3 復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和代謝

細(xì)菌BF 具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和代謝方式。BF 由胞外多糖交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)支架，表面附著互相粘連的菌體，BF 中具有孔道，類似原始的循環(huán)系統(tǒng)，可以運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物。BF 一旦建成，細(xì)菌排列密集且其代謝轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生胞外多聚物，因此細(xì)胞代謝活躍，但是以很低的速度分裂[13]。而且由于BF 中的營(yíng)養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物濃度、滲透壓和氧濃度等，自外向內(nèi)呈梯度下降，所以BF 外層或表層細(xì)菌生長(zhǎng)快速，內(nèi)層細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢。

4.4 難治性

4.4.1 抗吞噬性

包裹著細(xì)菌的黏性基質(zhì)將細(xì)菌和機(jī)體免疫系統(tǒng)隔開(kāi)，使機(jī)體的吞噬細(xì)胞和殺傷細(xì)胞及其所分泌的酶不能對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生有效的殺傷，可以逃避宿主免疫作用；同時(shí)BBF 能減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生或酶解細(xì)胞因子[14]。

4.4.2 耐藥性

當(dāng)細(xì)菌以BF 形式存在時(shí)耐藥性明顯增強(qiáng)(10～1000 倍)[14]。有效濃度的抗菌藥物能迅速殺死浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌和BF 表面的細(xì)菌，但對(duì)BF深處的細(xì)菌卻難以有效殺滅，但當(dāng)細(xì)菌從BF 上脫落下來(lái)成為浮游菌后，很快又對(duì)抗菌藥物恢復(fù)敏感。BF 的耐藥機(jī)制不同于浮游菌，原因可能是多方面的：①BF 的黏質(zhì)物屏障作用導(dǎo)致藥物進(jìn)入BF 受阻；②BF 中的細(xì)菌生長(zhǎng)速度較浮游菌明顯緩慢，尤其是BF 深層的細(xì)菌幾乎處于休眠狀態(tài)，而抗生素對(duì)快速生長(zhǎng)細(xì)胞更有殺傷力；③當(dāng)BF 內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量過(guò)多時(shí)，細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorom sensing，QS)會(huì)使一部分細(xì)菌從BF 表面脫離，導(dǎo)致感染擴(kuò)散或復(fù)發(fā)，引起臨床癥狀；④BF 中基因表達(dá)改變，使BF 菌株的生物學(xué)行為也隨之改變，導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生；⑤有的細(xì)菌能分泌抗生素分解酶，使之喪失抗菌效能，其中尤以β-內(nèi)酰胺酶引起的耐藥性最為重要；⑥許多細(xì)菌能產(chǎn)生抗生素外排泵，這種泵能夠?qū)⒋┻^(guò)細(xì)菌外膜的抗生素及時(shí)排出細(xì)菌體外，從而避免了抗生素與細(xì)菌的接觸；⑦激活應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌的生理學(xué)改變，使其在各種環(huán)境下得到保護(hù)；⑧對(duì)抗機(jī)體免疫防御體制[13-14]。

4.4.3 粘附性

細(xì)菌BF 的形成過(guò)程是細(xì)菌與材料表面接觸附著，在材料表面形成菌落，菌落生長(zhǎng)包埋于胞外多糖基質(zhì)中，有了BF 的保護(hù)，細(xì)菌就能抵抗清洗作用和消毒因子，造成清洗和消毒的失敗。大量研究證實(shí)，細(xì)菌BF 中的粘性胞外多糖與醫(yī)用材料(各種導(dǎo)管、人工瓣膜、起搏器、人工關(guān)節(jié)和隱型眼鏡等)污染導(dǎo)致醫(yī)院感染發(fā)生密切相關(guān)[15]。醫(yī)用材料在治療危重病患和慢性病患領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，易于附著細(xì)菌，如不能及時(shí)消除可能形成BF，成為醫(yī)院感染潛在因素。

4.5 胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

細(xì)菌BF 的形成需要胞間信號(hào)的相互傳遞，在BF 內(nèi)，細(xì)菌之間通過(guò)細(xì)菌的產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)信息傳遞，信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌定植在已形成菌落或定植在競(jìng)爭(zhēng)十分劇烈的環(huán)境表面起著十分重要的作用[9]；信號(hào)分子可以改變BF 內(nèi)的種群分布，改變相鄰細(xì)胞蛋白的表達(dá)，將某些遺傳特性(如抗藥性)傳遞給鄰近細(xì)胞。

4.6 分裂緩慢

在一個(gè)成熟的BF 內(nèi)，細(xì)胞很少或以很低的速度分裂。由于深層的細(xì)菌很難獲得養(yǎng)分和氧氣，代謝產(chǎn)物難以排出而堆積，菌體較小，不進(jìn)行頻繁的細(xì)胞分裂，此外BF 內(nèi)細(xì)菌分裂受到周圍多糖的限制。

4.7 細(xì)菌分布的規(guī)律性

BF 內(nèi)細(xì)菌分布并不是簡(jiǎn)單雜亂無(wú)章的[8]。無(wú)論是單菌種還是多菌種組成的BF 內(nèi)，細(xì)菌都不是隨機(jī)分布的，而是按各自的最適生存需求所組成。

綜上所述，細(xì)菌BF 與浮游細(xì)菌相比有許多不同的特性，且具有粘附、耐藥、抗機(jī)體免疫的特點(diǎn)，給臨床治療帶來(lái)很大的麻煩，所以早期發(fā)現(xiàn)易形成細(xì)菌BF 菌株，加強(qiáng)護(hù)理防止醫(yī)用材料和人體組織上細(xì)菌BF 的形成至關(guān)重要。雖然關(guān)于細(xì)菌BF 基本特性的研究已經(jīng)取得了初步進(jìn)展，但在BF 的組成結(jié)構(gòu)、形成機(jī)制和維持機(jī)制、BF 與機(jī)體免疫關(guān)系、耐藥等方面仍有許多復(fù)雜的機(jī)制尚無(wú)定論，特別是與BF 形成調(diào)控有關(guān)的關(guān)鍵基因的克隆及表達(dá)，對(duì)BF 形成機(jī)制分子水平的研究，以及實(shí)驗(yàn)室用何種方法確定BF 的存在，都有待我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

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