王桂秋

0 引言

前列腺癌是一種男性前列腺組織中的惡性腫瘤，其發(fā)病是前列腺腺泡細(xì)胞基因突變導(dǎo)致增殖不受控制的結(jié)果[1]。隨著病情的惡化，前列腺癌還會(huì)擴(kuò)散到鄰近器官，甚至轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位，尤其是淋巴結(jié)和骨髓[2]。臨床上，該病的治療包括手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法、激素療法單一治療或是幾種療法聯(lián)合應(yīng)用[3]。而中藥治療癌癥具有其獨(dú)特的好處，包括低毒、多靶點(diǎn)、藥性溫和等[4]?？鄥A提取自豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait)的根，具有利尿、抗病原體、抗肝炎、抗炎等作用，以及提高免疫力的藥理活性[5-6]。因此，在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)中，我們建立體外穩(wěn)定的前列腺癌PC-3M細(xì)胞模型，以細(xì)胞凋亡為研究目標(biāo)，進(jìn)一步探討苦參堿的抗腫瘤作用與凋亡相關(guān)通路的內(nèi)在聯(lián)系，為證明其對PC-3M促凋亡的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人前列腺癌PC-3M細(xì)胞，購自上海腫瘤研究所。

1.1.2 藥物與試劑 苦參堿(純度>98%)：Spectrum公司。DMEM培養(yǎng)基：Invitrogen公司。小牛血清：Amersco公司。胰蛋白酶：Amersco公司。0.25%胰酶：Gibco公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)：Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO)：南京建成生物工程研究所。PI染色試劑盒：Roche公司。Cyclin D1蛋白抗體：南京建成生物工程研究所。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。p-ERK1/2抗體：Invitrogen公司。蛋白裂解液：南京建成生物工程研究所。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：Invitrogen公司。

1.1.3 儀器 Model 311 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。SZX型超凈工作臺(tái)(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)。GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。JC303A-T電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都一恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌環(huán)境下，培養(yǎng)基RPMI-1640中加入新配置15% FBS、200 μg/mL青霉素、l50 μg/mL鏈霉素(4 ℃保存)。PC-3M細(xì)胞復(fù)蘇后，接種在培養(yǎng)瓶安置CO2培養(yǎng)箱中孵化(37 ℃，5% CO2)。D-Hank′s液沖洗3次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶液，置37 ℃約10 min。終止消化后，細(xì)胞懸液移入無菌刻度離心管中，低速離心10 min后消化3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟。

1.2.2 分組及給藥 精密稱取苦參堿100 μg，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的MR終濃度(0、30、60、120 μM)，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)5個(gè)平行孔/組，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，獲取平均值數(shù)據(jù)。應(yīng)用Graphpad Prism軟件計(jì)算IC50(半數(shù)抑制率)，即MR治療PC-3M細(xì)胞24、48、72 h后的IC50值。同時(shí)增設(shè)對照組。細(xì)胞增殖抑制率=(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

1.3 指標(biāo)檢測 MTT法檢測MR對PC-3M抑制率，PI染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá)，Western blot法檢測細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 MR給藥后對PC-3M細(xì)胞抑制作用 MTT法結(jié)果顯示，不同濃度MR抑制PC-3M的作用逐漸增強(qiáng)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，隨著時(shí)間的增加，MR的抑制作用不斷增強(qiáng)，提示MR治療有一定的時(shí)間-劑量依賴性。見圖1。

圖1 MR給藥對PC-3M細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 MR給藥后對PC-3M細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化的作用 PI染色結(jié)果表明，空白組中PC-3M的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，核仁透亮，核漿比例正常。30 μM濃度MR給藥72 h后，PC-3M細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)空泡增多，核收聚，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。而經(jīng)過60、120 μM濃度MR給藥，PC-3M細(xì)胞皺縮、脫落、密度降低，同時(shí)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)增多。見圖2。

圖2 MR給藥后對PC-3M細(xì)胞形態(tài)的影響(PI染色，×100)

2.3 MR給藥后對PC-3M細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，空白組中PC-3M細(xì)胞Cyclin D1陽性細(xì)胞數(shù)量較多，處于激活狀態(tài)。經(jīng)MR給藥后，PC-3M細(xì)胞Cyclin D1陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，結(jié)果顯示一定的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。見圖3。

圖3 MR給藥抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×100)

2.4 MR給藥后對PC-3M細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，空白組內(nèi)源性p-ERK1/2水平上調(diào)，處于過表達(dá)狀態(tài)。經(jīng)MR給藥后，PC-3M細(xì)胞增加的p-ERK1/2表達(dá)有效地下調(diào)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示一定的時(shí)間-劑量依賴性。見圖4。

3 討論

前列腺癌是嚴(yán)重危害男性生命的惡性癌癥之一，當(dāng)前主要采用放療、化療、手術(shù)、藥物治療等措施進(jìn)行防治，但都普遍存在預(yù)后差和復(fù)發(fā)性[7]。而傳統(tǒng)中藥在前列腺癌的防治工作方面獲得了有效的進(jìn)步[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，MTT結(jié)果表明，在生理狀態(tài)下PC-3M細(xì)胞增殖速度快，提示調(diào)控腫瘤細(xì)胞的過度增殖可以作為治療的方向。MR給藥后，能顯著抑制PC-3M增殖與分化，提示MR具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。此外，PI染色結(jié)果也說明，MR給藥能誘導(dǎo)PC-3M細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

圖4 MR給藥抑制PC-3M細(xì)胞p-ERK1/2的活性

Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一，不受控制的表達(dá)是原發(fā)性前列腺癌的特征，對臨床預(yù)后診斷具有重要意義[9]。腫瘤細(xì)胞中，Cyclin D1加速癌細(xì)胞周期素過度表達(dá)，同時(shí)造成CKIs細(xì)胞分裂的蛋白失活，從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和生長[10]。免疫組化結(jié)果顯示，PC-3M細(xì)胞內(nèi)源性Cyclin D1過度表達(dá)，說明Cyclin D1的異常表達(dá)促進(jìn)了PC-3M細(xì)胞不斷增殖和分化。MR給藥后，能有效抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)，提示MR通過抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用，結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2的生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，作用機(jī)制與其通過磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而引起靶蛋白的活性變化，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝功能[11]。此外，ERK1/2的抗凋亡作用與激活磷酸化抗凋亡分子(如bac-2，Bad等)以及激活轉(zhuǎn)錄因子(如Cyclin D1等)有關(guān)[12]。因此，藥物干預(yù)作用在腫瘤細(xì)胞的ERKl/2靶點(diǎn)有助于抑制其發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究表明，PC-3M細(xì)胞內(nèi)源性p-ERKl/2明顯上調(diào)。經(jīng)MR給藥后，PC-3M細(xì)胞p-ERKl/2的表達(dá)被有效地下調(diào)，提示MR作用與PC-3M細(xì)胞ERKl/2靶點(diǎn)，抑制其生理活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白組件Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，故推測MR抗腫瘤作用與其抑制癌細(xì)胞內(nèi)源性ERK1/2/Cyclin D1通路有關(guān)。

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