劉月環(huán)，毛棟森，吳舊生，鐘宇森，周莎桑，金曉音，柯賢福，應華忠

(1.浙江省醫(yī)學科學院，杭州 310013；2.浙江大學動物科學學院，杭州 310058)

高脂血癥是由脂肪代謝或運轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常的癥狀。流行病學調(diào)查表明，高脂血癥是誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病、胰腺炎、癌癥等多種疾病的主要危險因素之一[1]。2002年全國第四次營養(yǎng)調(diào)查研究覆蓋了全國31個省市，根據(jù)調(diào)查的數(shù)據(jù)估計，全國血脂異常的人群約1.6億[2]，由此可見，探索發(fā)病機理，研究高脂血癥防治措施和篩選有效治療藥物是今后的一項長期工作。理想動物模型是研究工作獲得重要進展的關(guān)鍵之一[3]，目前國內(nèi)實驗室使用較多的動物是大、小鼠，已有許多證據(jù)表明，大鼠和小鼠血清脂蛋白構(gòu)成、分布和體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程與人類存在較大差距，不能真實反映人的脂代謝狀態(tài)，且對高膽固醇不敏感。猴、豬、狗等大型動物病變與人類相似，但成本高、來源困難、造模時間較長。兔是膽固醇敏感動物，但其血清高密度脂蛋白比例過高，形成病變時間較長等，其使用受到限制。轉(zhuǎn)基因動物模型為血脂代謝和藥物評價提供了全新的實驗體系，但人類脂代謝紊亂和動脈粥樣硬化的形成是多基因所致，很難歸咎于單基因異常，同時由于傳代后遺傳性狀的穩(wěn)定性，價格昂貴等系列原因使其未能成為常用的高脂血癥和動脈粥樣硬化動物模型[4]。

自上個世紀六十年代以來，國內(nèi)外學者以高脂飼料誘發(fā)的長爪沙鼠高脂血癥的研究，結(jié)果表明該動物以其成模時間短(只需要四周)、性狀典型(與人類高脂血癥極為相似)、飼料配方簡便(不需要甲狀腺抑制藥物)而著稱[5-6]，但其遺傳基礎(chǔ)一直不明。為查明該問題，篩選培育高脂血癥長爪沙鼠新品系的遺傳標記，筆者自2005年以來建立了長爪沙鼠高脂飲食的高脂血癥模型[7]，用候選基因法對APOE、LCAT兩個基因的遺傳多態(tài)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在Z：ZCLA封閉群長爪沙鼠大群體中LCAT呈單態(tài)，而在ApoE基因發(fā)現(xiàn)了三個SNP，用這三個SNP對ZCLA兩個微生物等級封閉群進行了相應的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳效應的分析評價后，認為這三個SNP對于封閉繁育了30多年的ZCLA群體來說標記偏少，基因頻率偏低，于是我們引入新興的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，闡明與高脂血癥相關(guān)的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)及基因轉(zhuǎn)錄及表達的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時在群體水平上對該基因的遺傳力進行評價，期望盡快找到可利用的主效基因，防止ZCLA群體優(yōu)良基因的進一步丟失，加快篩選遺傳標記的進程。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗用長爪沙鼠由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供并飼養(yǎng)(實驗動物使用許可證：SCXK(浙)2008-0034，SYXK(浙)2008-0114，商品化飼料參照GB14923-2010生產(chǎn))。配合高脂飼料，選取90日齡長爪沙鼠(雌、雄性鼠兼用)60只，分為正常組(n=30)及模型組(n=30)，體重(50～70)g，正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，而模型組則飼喂基礎(chǔ)料70.5%(各成份的配比及生產(chǎn)按照GB14924-2001執(zhí)行)、豬油7%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉7%。造模型四周時取血清測定甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHO/TC)、低密度脂蛋白(LDL/LIP)、高密度脂蛋白(HDL)，飼養(yǎng)實驗進行四周，處死前進行CO2麻醉，大體解剖觀察肝臟形態(tài)，有明顯脂沉積者取作轉(zhuǎn)錄組RNA制備的樣本，兩組動物分別組成兩個RNA樣本池。

RNA-Seq 測序cDNA 文庫制備采用Illumina Satandard Kit 及QIA quick PCR purification KIT 試劑盒(Qiagen)試劑盒，具體操作按照說明書進行，測序在浙江大學納米研究院(Illumina GA IIx 測序平臺)。

1.2 RNA-Seq文庫的制備，read質(zhì)量的預處理及Unigene的de novo拼接

按照說明書，用Poly(T)寡聚核苷酸從上述2個總RNA池(正常組與模型組，每池取20 μg)中抽取帶 poly(A)尾的RNA，70℃溫度下裂解5 min，將其隨機打斷成片段。利用N6隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶將片段化的mRNA 合成cDNA 一鏈，繼而合成雙鏈cDNA，然后對二鏈cDNA 進行末端修飾將其連接到Illumina 雙端測序接頭上(adapter)，用于測序的cDNA 再經(jīng)過15個循環(huán)的PCR 線性擴增后經(jīng)富集和純化得到最終的cDNA 文庫。利用 通過Solexa RNA的paired-end測序進行5’ 和3’ 雙向RNA-Seq 測序，每個泳道產(chǎn)生數(shù)百萬條Read(樣本數(shù)據(jù))。鑒于Solexa數(shù)據(jù)錯誤率對結(jié)果的影響，對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量預處理(即用滑動窗口法去除低質(zhì)量片段，窗口長度為5 bp，長度閾值35 bp，質(zhì)量閾值20(錯誤率=1%)大小。將長爪沙鼠2組樣本的測序reads合并進行de novo拼接，使用軟件velvet_1.0.19，paired-end的拼接方法，得到許多unigene。

1.3 與公共數(shù)據(jù)庫的BLAST及基因的KEGG注釋與GO注釋

將拼接樣本unigene與公共數(shù)據(jù)gene進行比較，通過gene的同源性進行功能注釋?；蛳嗨票葘χ饕鞘褂没駼asic Local Alignment Search Tool (BLAST)算法[8]。樣本基因序列，分別與SWISS-PROT、CDD、PFAM、NR和TREMBL庫進行比對，取相似度>30%，且e<1e-5的注釋。利用WEGO對得到的基因進行g(shù)ene ontology ( GO )分類[9-10]，統(tǒng)計基因在Biological Process, Cellular Component, Molecular Function 三個類別的各GO term。進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway分析[11]，此分析是基于預測得到ORF序列，利用KAAS預測得到對應的KO號，然后利用KO號對應到KEGG pathway上，分析基因與KEGG中酶注釋的關(guān)系文件以及映射到pathway的信息。

1.4 計算長爪沙鼠基因表達豐度

用拼接得到的47 522個沙鼠基因做庫，用序列相似性比對的方法求各基因在各樣本中的表達豐度。使用軟件bowtie 0.12.7，single-end的mapping方法，允許一個reads比對到多個基因上(-v 3-a—phred64-quals)?；虮磉_估計方法用RPKM來表示，即以每個基因單位長度序列數(shù)的RPKM 值(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)來衡量，就是每百萬讀段中來自于某基因外顯子每千堿基長度的讀段數(shù)，公式如下：

1.5 差異表達基因分析及其GO和KEGG富集分析

應用DEGseq 程序包比較2個文庫中差異基因表達的情況[12]，根據(jù)各樣本基因的表達豐度值(FPKM)做基因的差異表達分析，包括：fold change分析，fisher檢驗，chisq檢驗等差異表達分析。對于以上各方法得到的差異基因，以fold change結(jié)果為準。將差異基因作為前景基因，全部基因作為背景基因，進行GO和KEGG的富集分析，使用超幾何分布算法(phyper)計算前景基因同GO/Pathway分類中某個特定分支的P值，并用FDR進行校正。

1.6 Q-PCR的驗證

提取純化的總RNA，檢測28 s 和18 s 質(zhì)量合格后，挑選10個差異倍數(shù)大于2的差異基因，設(shè)計引物，引物在上海睿迪生物公司合成。各目的基因引物序列以及退火溫度見表1。用普通PCR 方法對每個目的基因和持家基因進行擴增，然后通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，以確定每個基因擴增的特異性。在每板反應結(jié)束后，所有引物擴增系列均擬制溶解曲線，每個溶解曲線均只存在一個峰值，表明熒光定量PCR 擴增過程特異性較好，無非特異性擴增，這和前面普通PCR擴增電泳結(jié)果一致。實時定量PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt方法來表示。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)進行統(tǒng)計。采用配對T 檢驗法(Paired-Samples T Test)分析高脂血癥對長爪沙鼠基因表達的影響。試驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)表示方式為：平均值±標準誤(Mean±S.E)。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序的Q-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)的注釋

RNA-seq數(shù)據(jù)共6.68千萬條，平均長度94.63 bp，測序樣本均base滿足2G要求，De novo拼接后最終得到了有效鼠基因47 522個(即≥100 bp的unigene),大小26.9 Mb；約82.53%序列為比對到基因組上外顯子的序列; 其中長于1 000 bp的unigene有8 015個(表2)。

表2 拼接結(jié)果

2.2 基因表達差異及顯著性的分析

對得到的基因注釋分析是基于BLAST UniProt的結(jié)果 ( 即合并與Swiss-Prot和trEMBL的結(jié)果 )，Blast能夠?qū)崿F(xiàn)比較兩段核酸或者蛋白序列之間的同源性的功能，它能夠快速的找到兩段序列之間的同源序列并對比對區(qū)域進行打分以確定同源性的高低。利用得到的uniprot號比對GO term，拼接基因得到的所有注釋，詳細信息注釋上NR、SWISS-PROT、CDD、PFAM、TREMBL庫的基因分別有51.43%、49.20%、 50.93%、 32.65%、44.19%。

在level2的基礎(chǔ)將5 365個GO分別按照分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)和細胞成分(cellular component, CC)進行分類，以上三種方法的分類信息分別含有 621個GO (13.2%)、1 989個GO (37.1%)和706個GO (11.6%)，剩下的為沒有任何分類信息的基因。GO主要是信號傳導、細胞粘附、細胞凋亡、細胞分化、免疫反應、炎癥反應、氨基酸代謝、維生素合成與代謝，能量代謝、膽固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞脂質(zhì)代謝過程、甘油三酯代謝過程、脂質(zhì)分解過程、脂肪細胞分化、脂肪酸分解過程、甘油三酯生物合成過程、細胞因子調(diào)節(jié)信號通路、胰島素受體信號通路、膽固醇平衡、細胞因子形成等 (P<0.001)。 共有12 914個基因注釋到282個pathway，其中包括1 004個酶，表3列示了注釋上基因最多的5個pathway，圖1(見彩插4)列示了長爪沙鼠unigene注釋到ko00010(其中紅色表示注釋上的基因)。

表3 長爪沙鼠unigene注釋上基因最多的5個pathway

2.4 Q-PCR驗證

以肝臟組織cDNA 作為模板，對模板進行 10倍濃度梯度稀釋，以優(yōu)化后的反應條件進行擴增，得到各基因的標準曲線，標準曲線的R2值都大于0.980，且各基因的擴增效率都處于95%～105% 之間，目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率都接近100%，且它們之間擴增效率相對偏差不超過5%，可以用于熒光定量PCR分析(圖2)。

圖2 七個基因Q-PCR驗證的結(jié)果

使用2倍上調(diào)/下調(diào)的fold change閾值統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，本研究中，誘發(fā)高脂血癥與正常動物之間共獲得21 125 差異基因，16 087個下調(diào)，5 038個上調(diào)，總體上模型組相對于正常組存在較顯著的趨勢性下調(diào)關(guān)系。

2.5 與炎癥通路相關(guān)的基因及其表達量

共有8個通路[13]與長爪沙鼠高脂血癥代謝性炎癥密切相關(guān)(P<0.01)，分別是ECM受體的相互作用途徑(ko04512)、細胞粘附分子途徑 (ko04514)、細胞因子受體相互作用 (ko04060)、粘著 (ko04514/04510)、白細胞跨內(nèi)皮遷移 (ko04670)、趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路 (ko04062)、補體和凝血級聯(lián) (ko04610)與抗原處理與演示 (ko04612)，其余通路(如JAK-STAT信號通路 (ko04630)、MAPK信號通路(ko04010)、Toll樣受體信號通路(ko04620)、B細胞受體信號通路(ko04662)、急性髓細胞白血病(ko05221)、溶酶體(ko04142)，ABC轉(zhuǎn)運子(ko02010)等均未達顯著水平。對照組是實驗組2倍以上的基因有LAMA1(層粘連蛋白)、LAMA2(層粘連蛋白)、ITGB3(整合，β3(Ⅲa的血小板膜糖蛋白CD61抗原))、MHC I (主要組織相容性復合體)、MHC II(主要組織相容性復合體)、CLDN5(緊密連接5)、PTPRC(蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶，受體類型C)、CD58(CD58分子)、PTPRC(細 胞 粘 附 分 子 途 徑)、EPOR(細胞因子細胞因子受體相互作用途徑)、PPPICB(蛋白磷酸酶1催化亞基，β同工酶)、ACTB(肌動蛋白，β)、JUN(c-Jun蛋白)，XCR1(趨化因子(C模式)受體1)和CR1(補體受體I型)。15個與免疫和炎癥相關(guān)的基因表達均顯著下調(diào)，其中JUN表達下調(diào)五倍，EPOR(促紅細胞生長素受體)，XCR1(趨化因子(C模式)受體1)，CR1(補體受體1型)下調(diào)超過3倍。

3 討論

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體最主要的調(diào)控方式，而RNA-Seq 技術(shù)最基本的應用也是檢測基因的表達水平，它對同一樣品深度測序可以捕獲低表達的基因，而對大量樣品同時測序可以獲得樣品之間的表達差異[14]。Mortazavi等[15]利用Solexa 技術(shù)進行了小鼠的4種不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序，他們發(fā)現(xiàn)有90%的序列比對上基因組上的外顯子區(qū)域，剩下的10%序列比對上的區(qū)域可能是未知的一些轉(zhuǎn)錄區(qū)域。Pan 等[16]利用Solexa 測序儀進行了人的轉(zhuǎn)錄組測序，首次利用新一代測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)和檢測了選擇性剪切。對于高脂血癥這樣的多基因疾病，弄清疾病發(fā)作期病變器官(如肝臟)高表達的基因，全面地評價模型，或篩選出高脂血癥的主基因或高效應SNP標記，培育高脂血癥的新品系，具有十分重要而現(xiàn)實的科學意義。

代謝性炎癥是由于攝入營養(yǎng)物和代謝過剩而觸發(fā)炎癥的過程，是一種低程度的系統(tǒng)性炎癥。在長期的進化過程中,各種生物都形成了代謝和免疫反應的公共通路，也可以說機體對營養(yǎng)物質(zhì)和病原體形成相同的感應系統(tǒng)，營養(yǎng)物質(zhì)的攝入與病原體的入侵一樣，除可引起代謝系統(tǒng)的反應外，還可像病原體一樣誘發(fā)免疫系統(tǒng)的紊亂[17]。它涉及與經(jīng)典炎癥類似的分子和信號轉(zhuǎn)導通路，也可造成多種炎性分子的表達和活性增強，而且這種炎癥可以持續(xù)長期存在，在造成相關(guān)器官形態(tài)和功能損傷的基礎(chǔ)上對機體的生理功能產(chǎn)生嚴重的影響[18]。Lee等[19]利用基因芯片檢測了印度肥胖和非肥胖患者腹部脂肪組織細胞基因表達差異情況，結(jié)果表明，肥胖患者腹部脂肪細胞中大量與炎癥和免疫相關(guān)的基因表達發(fā)生變化，其中52個表達上調(diào)，2個表達下調(diào)。這些基因中包括如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(C1QTNF5)、白介素1(IL-1B)和巨噬細胞移動抑制因子(MIF)等。Xie等[20]用高脂飼喂Wistar大鼠16周后誘發(fā)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，用基因芯片檢測到了130多個基因上調(diào)，而涉及炎癥的PPAR通路下調(diào)。在本研究發(fā)現(xiàn)實驗組的8個通路中15個與免疫和炎癥相關(guān)的基因表達均顯著下調(diào)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病機制理論“二次打擊學說”[21]認為，一次打擊誘發(fā)脂肪變性，隨后在應激產(chǎn)生的細胞因子、持續(xù)存在的原有致病因素、肝星狀細胞活化等作用下發(fā)生二次打擊，導致肝臟發(fā)生炎癥、壞死、細胞凋亡以及纖維化等。據(jù)此推測飲食誘導的高脂血癥長爪沙鼠模型在造模型四周中存在兩種可能，一種是處在一次打擊期內(nèi)，主要通過促使外周脂肪分解增加和胰島素血癥引起肝細胞脂肪堆積，所以機體表現(xiàn)只有高脂血癥，肝臟脂肪變性，沒有發(fā)生炎癥[22]，還有一種可能是發(fā)生了輕微的炎癥，由于機體組織適應性反應機制的抗氧化、抗細胞調(diào)亡、瘦素的抗脂肪毒性等防御功能可與上述因素相抗衡繼而機體自行修復[23]，其過程大致是，首先與炎癥相關(guān)的受體和信號通路增強如ECM受體的相互作用和趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路、細胞間粘附因子增多如細胞粘附分子、細胞因子與細胞因子受體相互作用、粘著等下調(diào)，然后炎癥發(fā)生過程的相關(guān)代謝如白細胞跨內(nèi)皮遷移、抗原處理和演示、補體和凝血級聯(lián)也下調(diào)，表現(xiàn)為實驗組長爪沙鼠肝臟因高脂血癥發(fā)生炎癥反應，繼而發(fā)生抑制炎癥與組織修復[24]。

本研究獲得的上述差異基因與關(guān)鍵通路的功能需要繼續(xù)進行相關(guān)驗證，具體可以通過構(gòu)建基因敲除或沉默載體來創(chuàng)建基因缺陷型細胞系(或動物模型)，既可以進行單靶點操作，也可以多靶點操作，還可以利用轉(zhuǎn)錄組海量數(shù)據(jù)篩選出可用的微衛(wèi)星標記，鑒定有功能的SNP，進而發(fā)展成為培育近交系的遺傳標記。另外，由于在真核生物中，選擇性剪切現(xiàn)象普遍存在，選擇性剪接方式不同產(chǎn)生的功能基因不同，基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA 前體(pre-mRNA)過程中可形成不同的剪切異構(gòu)體和基因表達，可能會對高脂血癥的表型影響不同，因此尋找新的轉(zhuǎn)錄本和剪接方式也成為今后的研究主要方向之一。

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