陸紅玲，湯 陽， 黃 躍，錢民章，馮贊杰

(1.遵義醫(yī)學院生物化學教研室；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院心胸外科；3.遵義醫(yī)學院形態(tài)學實驗室，遵義 563099)

高同型半胱氨酸血癥能明顯增加心血管動脈硬化病變和其他疾病的發(fā)生[1]，嚴重威脅人們生命健康安全。要了解其導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)的發(fā)病原因和機制，需要建成或復制As動物模型。很多文獻報道復制高脂血癥誘導的As動物模型常采用動脈球囊損傷術，以促進As病變的形成。本實驗也試圖在頸動脈球囊拉傷基礎上加以皮下注射甲硫氨酸，以建立高同型半胱氨酸動脈粥樣硬化模型。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及器材

L-甲硫氨酸(北京索萊寶有限公司)、同型半胱氨酸試劑盒(美國Sigma公司)、冠狀動脈擴張球囊(美國強生公司CARDIC系列)、顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本奧林巴斯 CX41、德國徠卡公司)、酶標儀(澳大利亞Tecan, Safire)、切片機(德國徠卡公司)。

1.2 實驗動物及分組

新西蘭兔20只(重慶市中藥研究院動物所，生產(chǎn)許可證SCXK(渝)2007-0006， SYXK(黔)2011-003)，雌雄不限，體重(2.0～2.5)kg。隨機分為對照組、As模型組，每組10只。所有動物均單籠飼養(yǎng)，飲水不限，自由攝食，每日每只予150 g普通飼料，喂養(yǎng)24周。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法：家兔予普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，于第2周行頸動脈球囊拉傷術，術前12 h禁食不禁水。用3%戊巴比妥溶液(1 mL/kg)腹腔麻醉動物后仰面固定于手術臺，充分暴露頸部，捫及甲狀軟骨及氣管軟骨環(huán)，于周邊區(qū)域剪毛常規(guī)皮膚消毒，頸部正中切口，長度約3 cm，選取左側(cè)頸動脈為手術損傷側(cè)。血管鉗分離氣管前筯膜及頸前肌群，暴露血管，充分游離左頸總動脈、頸內(nèi)及頸外動脈，暫時阻斷左頸總動脈近心及遠心端血流。三股7號絲線穿過頸外動脈血管，遠心端結(jié)扎，近心端先予動脈夾閉，在兩端之間的動脈壁上約呈45度剪開一“v”形小口，向近心端置入2.5 mm × 20 mm 直徑球囊導管，開放動脈夾，使球囊進入近心端動脈，并向頸總動脈起始部推送，推送長度約 3～4 cm，連接手推式壓力泵，注入肝素生理鹽水，然后將氣囊充氣，壓力為6 個大氣壓，來回移動球囊(以回拉時有明顯阻力感，又可以拉動球囊為宜)，使之與動脈內(nèi)膜摩擦，造成內(nèi)膜機械損傷。來回摩擦3～5次后，釋放球囊氣體，退出導管，在穿刺點近心端用7 號絲線雙重結(jié)扎頸外動脈，恢復血流，逐層縫合頸前肌群、氣管前筯膜及皮膚，酒精消毒皮膚。術后連續(xù) 3 d 每日肌注青霉素 80 萬單位預防感染。術后對照組每日皮下注射生理鹽水，模型組每日皮下注射甲硫氨酸80 mg/(kg·d)。

1.3.2 標本的采集與處理:

1.3.2.1 兔血清同型半胱氨酸含量檢測：于頸動脈球囊拉傷術前及第24周實驗結(jié)束時，各采集家兔耳緣靜脈血8 mL，靜置30 min后, 以3 000 r/min離心10 min，收集血清置-80℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法( EL ISA) 檢測同型半胱氨酸含量。

1.3.2.2 動脈病理標本的采集及觀察:第24周取材，用3%戊巴比妥溶液(1 mL/kg)腹腔麻醉動物后仰臥固定于手術臺，麻醉起效后空氣栓塞法處死動物，自頸部正中切開，切口約10 cm，打開胸腹腔，暴露血管并充分游離，取出雙側(cè)頸總動脈、胸主動脈及腹主動脈。用眼科剪沿縱軸剪開血管，用生理鹽水輕輕沖洗以去除血污及血凝塊，以肉眼大體觀察動脈內(nèi)壁情況后，將標本置于4%甲醛溶液固定12 h，石蠟包埋切片，每個標本切3張切片行 HE染色。于光鏡下觀察各部位動脈病變，拍照圖像輸入MiE顯微圖像處理軟件，并測量血管壁厚度。

1.3.3 同型半胱氨酸誘導的家兔動脈粥樣硬化病變模型復制成功判斷：光鏡下見血管壁彌漫性隆起，突向管腔面，內(nèi)膜增厚，平滑肌細胞增生，膠原纖維和彈性纖維增多，中層結(jié)構(gòu)紊亂等即可確認。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 血清同型半胱氨酸含量檢測

造模24周后，與對照組相比，As模型組家兔血清同型半胱氨酸含量明顯升高(P< 0.05)。結(jié)果見表1。

表1 家兔血清同型半胱氨酸水平(n=10)

Tab.1 Levels of serum hyperhomocysteinemia

表1 家兔血清同型半胱氨酸水平(n=10)

* : compare with control, P < 0.05；

組別Groups0周Week 024周Week 24對照組 Control7.29±2.556.42±2.20模型組 Model8.53±2.0826.35±2.34?

2.2 動脈病理學變化

2.2.1 動脈粥樣硬化病變的觀察：肉眼觀：對照組右側(cè)頸動脈及胸、腹主動脈管壁光滑有彈性，顏色均勻；左側(cè)損傷頸動脈除結(jié)扎部位血管變細、顏色變白并有部分血栓形成外，未見明顯斑塊形成。As模型組雙側(cè)頸動脈及胸、腹主動脈壁觸之彈性減弱，局部有管壁變硬縮窄，似有增生；損傷側(cè)頸動脈還可見血管局部片狀顏色較深的損傷區(qū)域，有血栓形成。鏡下觀：正常對照組未損傷側(cè)頸動脈及胸、腹主動脈血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細胞排列整齊，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，內(nèi)皮下未見脂質(zhì)及炎性細胞浸潤，中層及外膜結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯病理改變(圖1A)。損傷側(cè)頸動脈結(jié)扎部位形成血栓，可見大量炎性細胞浸潤，并有新生小血管生成(圖1B)。As模型組：雙側(cè)頸動脈及胸、腹主動脈三層結(jié)構(gòu)界限模糊，可見血管壁向管腔隆起(圖1C)；中層結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細胞增生，膠原纖維和彈性纖維增多，內(nèi)膜增生，有大量巨噬細胞浸潤(見圖1D)，血管壁出現(xiàn)不同程度地增厚；損傷側(cè)動脈結(jié)扎部位除上述病理改變外，也可見血栓形成伴新生小血管生成(見圖1E)，圖1見彩插3)。

2.2.2 動脈血管壁厚度檢測：各組檢測了家兔頸動脈損傷側(cè)及未損傷側(cè)血管壁厚度，平均厚度如表2所示。各組損傷側(cè)頸動脈血管壁厚度與未損傷側(cè)比較均差異顯著(P<0.05)，但兩組損傷側(cè)管壁厚度比較無差異。同時檢測了對照組與模型組損傷側(cè)頸動脈厚度增加比值([損傷側(cè)動脈厚度-未損傷側(cè)動脈厚度]/未損傷側(cè)動脈厚度)，兩組比值無統(tǒng)計學差異。

表2 各組家兔頸動脈壁厚度(n=10)

此外還檢測了各組家兔頸總動脈及胸、腹主動脈血管壁厚度(表3)，與對照組相應部位比較，模型組上述部位動脈管壁均出現(xiàn)不同程度地增厚(P<0.05)，以胸主動脈最明顯。而球囊損傷側(cè)頸動脈壁厚度與頸總動脈及腹主動脈無差異。

表3 各組家兔動脈壁厚度(n=10)

3 討論

動脈粥樣硬化所引起的疾病發(fā)病率及死亡率日益增高，在我國亦呈快速增長趨勢。其病因及發(fā)病機制復雜，其中高同型半胱氨酸血癥作為誘導動脈粥樣硬化形成的獨立危險因子已越來越受到重視[3]。本研究參照文獻[2]采用皮下注射甲硫氨酸制作高同型半胱氨酸血癥模型，結(jié)果顯示，實驗組家兔的胸、腹主動脈及頸總動脈等部位均出現(xiàn)了不同程度地As病理改變。肉眼觀察，可見動脈管壁顏色不均勻，觸之彈性減弱，局部有管壁變硬縮窄。鏡下見血管壁彌漫性增厚，局部隆起突向管腔面，中層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜下有不規(guī)則平滑肌細胞增生，膠原纖維和彈性纖維增多，見巨噬細胞浸潤。建立As模型的方法有很多，球囊損傷胸/腹/股動脈加高脂飼料建立As模型[4-6]，或球囊損傷建立頸總動脈狹窄的模型[7]常被廣泛應用。為此我們在建立模型過程中也使用了球囊拉傷頸動脈內(nèi)膜的方法，想有助于快速誘導動脈粥樣硬化模型形成，但實驗中發(fā)現(xiàn)，行動脈內(nèi)膜球囊損傷需對實驗家兔進行血管切開，操作完成后還需結(jié)扎損傷的血管，對動物損傷較大，且具有一定的死亡率。而實驗結(jié)束時經(jīng)對損傷部位血管觀察，可見內(nèi)膜損傷、斷裂、增生，炎性物質(zhì)附著，平滑肌纖維增生，管腔堵塞及小血管再生等病變，因此無法證實損傷側(cè)血管的繼發(fā)改變是球囊牽拉損傷內(nèi)膜所致，還是高同型半胱氨酸血癥誘導所致。與未損傷且出現(xiàn)了As病理改變的其他部位動脈比較，球囊損傷側(cè)頸動脈壁厚度與頸總動脈及腹主動脈無差異；已形成高同型半胱氨酸血癥的模型組頸動脈壁厚度增加比值與對照組比較也無差異。因此我們認為球囊損傷對高同型半胱氨酸血癥誘導的動脈粥樣硬化模型形成無明顯作用，且牽拉導致的動脈內(nèi)膜損傷會影響實驗結(jié)果觀測(如圖B與圖E鏡下病理改變無明顯差異)。與高脂血癥誘導的動脈粥樣硬化病變相比，高同型半胱氨酸血癥導致的動脈病理改變沒有明顯的泡沫細胞形成，也沒有典型的粥樣斑塊產(chǎn)生，而是以動脈炎癥反應、內(nèi)膜及平滑肌增生、動脈內(nèi)壁結(jié)構(gòu)紊亂等為更主要的可見的病理特征。推測同型半胱氨酸刺激平滑肌細胞增殖效應可能是通過核內(nèi)癌基因、細胞周期調(diào)控蛋白及PKC/MAPK信號傳導等途徑實現(xiàn)的[8-10]，具體機制有待進一步研究。

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