遲福艷， 薛 云，戴學(xué)棟，馬玉奎

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 262600；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250033)

人們普遍認(rèn)為中藥的藥性平和、不良反應(yīng)小、安全可靠。但隨著中藥新品種及新劑型不斷出現(xiàn)，特別是中藥注射液的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)也日益突出，漸漸引起人們的重視。中藥注射劑成分往往復(fù)雜，所引起的不良反應(yīng)也不能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)引起的機(jī)制。鑒于近年臨床上中藥注射劑引發(fā)的不良反應(yīng)事故頻發(fā)，為全面提高中藥注射劑的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，SFDA下發(fā)了《關(guān)于開展中藥注射劑安全性再評價(jià)工作的通知》(國食藥監(jiān)辦〔2009〕28號)。按照SFDA的要求，我們在GLP條件下對丹紅注射液進(jìn)行了臨床前安全性再評價(jià)研究。本試驗(yàn)通過觀察13周重復(fù)靜脈給予丹紅注射液后Beagle犬所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，預(yù)測臨床用藥中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，提示臨床用藥中需重點(diǎn)監(jiān)測的指標(biāo)，為臨床用藥的安全性提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

Beagle犬，合格證號：SCXK(京)2011-0003，雌雄各半，體重范圍為(6～8)kg，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于普通級環(huán)境，室溫(19～26)℃，濕度40%～70%，日溫差≤4℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(魯)20100004。

1.2 儀器與試劑

BS300型生化分析儀(深圳邁瑞公司制造)，用于血液生化學(xué)檢測。C2000型血凝儀(北京東方普利生制造)，用于血液學(xué)檢測。TCS-150型電子臺秤(精確到0.01 kg，梅特勒-托利多儀器(常州)有限公司制造)，用于動(dòng)物體重測定。TP1020生物組織脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)、DMLS2型顯微鏡(德國萊卡公司制造)，以上儀器用于組織病理學(xué)檢查。

丹紅注射液(濃縮液)由濟(jì)南步長制藥有限公司提供，每1 mL中含總黃酮以蘆丁計(jì)為49.4 mg/mL(批號110511)；血液學(xué)檢測試劑盒，由煙臺卓越生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。血凝檢測試劑盒由德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH生產(chǎn)。血液生化學(xué)檢測試劑盒由邁瑞上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法[1]

按照中藥注射劑安全性再評價(jià)非臨床研究評價(jià)技術(shù)原則要求，亞慢性毒性試驗(yàn)應(yīng)采用嚙齒類和非嚙類兩種動(dòng)物；對于丹紅注射液的大鼠亞慢性毒性研究已有報(bào)道[2]，但未見非嚙齒類毒性研究，故本試驗(yàn)采用檢疫合格的Beagle犬24只，雌雄各12只，按體重均衡原則分為4組，即溶劑對照組和丹紅注射液3個(gè)不同劑量給藥組(494，247，124 mg/kg)，給藥容積為10 mL/kg，對照組同法給予10 mL/kg的生理鹽水，每天1次給藥，每周給藥6 d，停藥1 d，給藥周期為13周，恢復(fù)期設(shè)為4周。

1.4 劑量設(shè)計(jì)依據(jù)[1]

中藥、天然藥物長期毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則中規(guī)定，長期毒性試驗(yàn)高劑量原則上使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，低劑量原則上高于動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)的等效劑量、并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)，結(jié)合毒性作用機(jī)制和模式在高劑量和低劑量之間設(shè)立中劑量，以考察毒性反應(yīng)劑量-反應(yīng)關(guān)系。

丹紅注射液臨床用藥劑量以蘆丁計(jì)為7.5 mg/kg，折算為犬的等效劑量為12 mg/kg。同時(shí)，Beagle犬急毒結(jié)果顯示，667 mg/kg劑量給藥后，Beagle犬出現(xiàn)嘔吐、呼吸急促、后肢無力，活動(dòng)減少等毒性反應(yīng)，約(4～8) min恢復(fù)正常，445 mg/kg劑量給藥后犬出現(xiàn)后肢無力和活動(dòng)減少等毒性反應(yīng)，約2 min恢復(fù)正常，296 mg/kg劑量給藥后犬未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)。參考急毒結(jié)果，按照技術(shù)指導(dǎo)原則要求，將494 mg/kg設(shè)計(jì)為亞慢性毒性試驗(yàn)的高劑量，此劑量為臨床劑量的66倍，藥效學(xué)等效劑量的41倍，124 mg/kg為低劑量，為臨床用藥劑量的16倍，藥效學(xué)等效劑量的10倍。

2 結(jié)果

2.1 一般體征觀察

高劑量組所有動(dòng)物給藥過程中均出現(xiàn)流涎和嘔吐反應(yīng)；中劑量組所有動(dòng)物出現(xiàn)流涎，2只動(dòng)物偶爾出現(xiàn)嘔吐反應(yīng)；低劑量組和溶劑對照組所有動(dòng)物均未見任何異常反應(yīng)。

2.2 體重變化

與溶劑對照組比較，494 mg/kg劑量組動(dòng)物體重增長率明顯偏低，在第1、2周出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明丹紅注射液494 mg/kg劑量下可抑制Beagle犬體重增長；247 mg/kg和124 mg/kg劑量對Beagle犬體重?zé)o明顯影響。見表1。

表1 丹紅注射液對Beagle犬體重增長率的影響

2.3 血液學(xué)及血液生化學(xué)結(jié)果

參考本中心Beagle犬的背景數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)[3]，并與溶劑對照組比較，丹紅注射液所有劑量組的血液學(xué)、心電等指標(biāo)未見任何異常；TT、PT和TT明顯延長，高劑量組動(dòng)物血清中BUN和CR明顯升高，出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05或P﹤0.01)；其它兩個(gè)劑量組血液生化學(xué)指標(biāo)基本在正常范圍內(nèi)。高劑量組動(dòng)物血清中BUN和CR的升高停藥4周后可恢復(fù)正常。給藥結(jié)束時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)結(jié)果如表2所示。

表2 Beagle犬異常的血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)

2.4 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

丹紅注射液高、中、低三個(gè)劑量組所有動(dòng)物臟器重量均在正常范圍內(nèi)，各臟器未見肉眼可見病變。病理檢查結(jié)果顯示，494mg/kg劑量組50%動(dòng)物肝臟枯否氏細(xì)胞增生，胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒；溶劑對照組及中、低劑量組所有動(dòng)物所有臟器均未見藥物相關(guān)性病理組織學(xué)病變(圖1見彩插1)。

3 討論

尿素氮(BUN)是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，腎臟為排泄尿素氮的主要器官；肌酐(CR)是肌酸和磷酸肌酸代謝的終產(chǎn)物，它的排泄量反映血液中的肌酸酐含量和腎小球的過濾速率，也就是腎臟的機(jī)能，當(dāng)腎發(fā)生病變時(shí)，肌酐排泄受阻，血液中肌酸酐含量升高。通過測定血液中肌酐和尿素氮含量的測定，可檢測腎功能是否異常[4，5]。本研究中，高劑量組Beagle犬血清中BUN和CR明顯升高，表明丹紅注射液494 mg/kg劑量下對腎臟功能有明顯的損傷，病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，未見明顯的組織病理學(xué)病變，說明對腎臟的損傷僅僅是功能性損傷，并未有實(shí)質(zhì)性病變?；钛鲱愃幬锟梢鹉獣r(shí)間延長，本試驗(yàn)中，犬血液的PT(凝血酶原時(shí)間)、APTT(活化部分凝血活酶時(shí)間)和TT(凝血酶時(shí)間)明顯延長，分析原因?yàn)榈ぜt注射液具有活血化瘀作用，凝血時(shí)間的延長為丹紅注射液的藥效作用，無毒理學(xué)意義。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，高劑量組50%動(dòng)物肝臟枯否氏細(xì)胞增生，胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，分析原因?yàn)榈ぜt注射液自靜脈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，作為異物可能會(huì)激活肝臟的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使巨噬細(xì)胞增生，繼而吞噬異物顆粒，直至清除。

Beagle犬亞慢性毒性試驗(yàn)可描述犬重復(fù)給予供試品后的毒性反應(yīng)，是非臨床安全性評價(jià)的重要內(nèi)容，也是中藥注射液再評價(jià)必須進(jìn)行的研究項(xiàng)目。通過亞慢性毒性試驗(yàn)可以預(yù)測藥物可能引起的臨床不良反應(yīng)的性質(zhì)、程度、量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系、可逆性等；也可判斷藥物可能的毒性靶器官或組織，推測臨床用藥的安全范圍，指導(dǎo)臨床安全用藥。本研究結(jié)果顯示，丹紅注射液靜脈注射給藥，其無毒反應(yīng)劑量為124 mg/kg，其主要的中毒靶器官為肝

臟和腎臟等，提示臨床應(yīng)用中應(yīng)密切監(jiān)測患者以上器官的功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中藥、天然藥物長期毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S]. 國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā), 2005, 3.

[2] 王保中, 曹茂榮, 鄒薇紅, 等. 丹紅注射液毒理學(xué)研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2008, 3(11):27-29.

[3] 楊鋒, 王紅星, 何永亮, 等. 實(shí)驗(yàn)Beagle犬血液學(xué)及血液生物化學(xué)參考值的探討[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 14(6):355-358.

[4] 周宗燦. 毒理學(xué)教程[M]. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2006: 425-427.

[6] 任麗, 蔣素華, 劉紅, 等. 血肌酐水平、MDRD-GRF、CG-GRF與腎小管間質(zhì)病變相關(guān)性研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2010,22(7):2436-2438.