黃 昌, 郭家彬, 馮 敏, 彭雙清△

(1廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530021； 2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心，北京 100071)

金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是一類富含半胱氨酸殘基并與金屬離子結(jié)合的小分子蛋白，廣泛分布于細(xì)菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)[1]，由于疏基和金屬含量極高加上結(jié)構(gòu)特殊，因此被稱為金屬硫蛋白。MTs廣泛參與細(xì)胞生命活動的調(diào)節(jié)過程，其生物學(xué)功能主要有維持金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、解毒重金屬、清除氧自由基、抑制炎癥因子等[2]。近年來，越來越多的證據(jù)顯示MTs在抗氧化損傷和抑制細(xì)胞凋亡方面具有顯著作用，特別是MTs參與線粒體功能的調(diào)節(jié)及具體作用機(jī)制倍受關(guān)注，認(rèn)為MTs具有維持線粒體功能和促進(jìn)線粒體損傷修復(fù)作用。由于線粒體功能結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。據(jù)目前的研究結(jié)果顯示MTs可能參與線粒體的呼吸鏈、能量代謝、線粒體酶活性、金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡信號通路和線粒體生成等生理過程的調(diào)節(jié)。本文將重點(diǎn)對MTs的生物學(xué)功及其對線粒體功能調(diào)節(jié)的影響進(jìn)行綜述，闡明MTs與線粒體生理功能的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。

1 金屬硫蛋白的生物學(xué)特征

自1957年發(fā)現(xiàn)MTs作為一類金屬結(jié)合蛋白以來其功能特征包括物理、化學(xué)和生物學(xué)性能均得到廣泛研究。哺乳類動物體內(nèi)MTs包含有61～68個氨基酸，其中20個為半胱氨酸。MTs可分為4個亞型MT(I～I(xiàn)V)，各亞型的差異主要體現(xiàn)在翻譯后蛋白一級結(jié)構(gòu)的修飾上，表現(xiàn)為金屬離子整合和降解速度的不同。盡管各亞型的物理化學(xué)性質(zhì)相似，但是在機(jī)體的表達(dá)分布及生物學(xué)功能卻有很大的差別。MT-I和MT-II幾乎同時出現(xiàn)在所有的軟組織中，是MTs的主要異構(gòu)形式；MT-III主要在大腦組織表達(dá)，在心臟，腎臟和生殖器官也有少量表達(dá)，與MT-I/II最大區(qū)別是抑制神經(jīng)生長因子的作用；MT-IV主要是在口腔上皮、食管、胃上部、尾巴、腳底和新生兒皮膚的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。MTs在細(xì)胞中的表達(dá)主要是通過金屬離子順式應(yīng)答元件和氧化應(yīng)激反應(yīng)元件對MTs的啟動子近端進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。在正常生理狀態(tài)下，MTs在細(xì)胞中的表達(dá)水平比較低，生物學(xué)功能并未發(fā)揮顯著的作用。在藥物毒性、氧化物質(zhì)或金屬離子等各種應(yīng)激因子的誘導(dǎo)下MT的表達(dá)可以在1 h內(nèi)迅速上調(diào)并持續(xù)到應(yīng)激后24 h，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[4-7]。

2 線粒體功能

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞有氧呼吸和供能的主要場所，通過線粒體的氧化磷酸化可以為細(xì)胞生命活動提供95%的能量。線粒體是細(xì)胞內(nèi)除了細(xì)胞核外唯一具有遺傳功能的細(xì)胞器，含有幾個自身遺傳環(huán)狀mtDNA，具有半保留自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。線粒體在氨基酸合成、脂質(zhì)代謝、亞鐵紅素合成、金屬離子代謝、鈣通路、細(xì)胞信號調(diào)控和細(xì)胞凋亡等方面起著重要作用[11]。線粒體功能紊亂將導(dǎo)致退行性和老化性疾病發(fā)生。已有大量文獻(xiàn)說明許多疾病與線粒體功能障礙相關(guān)，包括心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病、癌癥、老年病和免疫缺陷綜合癥等。

在線粒體基質(zhì)內(nèi)，通過三羧酸循環(huán)酶系將底物脫氫氧化生成NADH，NADH通過線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化成NAD，與此同時，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和跨膜電位。在病理、化學(xué)物質(zhì)應(yīng)激下，線粒體酶和蛋白的功能受損，導(dǎo)致多種電子傳遞鏈的復(fù)合物(I～I(xiàn)V)和載體(泛醌、細(xì)胞色素C)的電子傳遞功能失效，大量的電子泄漏并與氧分子結(jié)合生成超氧陰離子，在超氧歧化酶作用下快速轉(zhuǎn)化成過氧化氫，氧自由基迅速增多導(dǎo)致線粒體膜的功能結(jié)構(gòu)破壞和mtDNA突變率增加，引起氧化磷酸化功能和電子傳遞鏈酶活性進(jìn)一步降低，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致線粒體功能紊亂[12-13]。

人體內(nèi)每天大量的物質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜，在線粒體膜與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器之間的物質(zhì)交換需要大量的載體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞通道來完成。線粒體膜的運(yùn)輸通道蛋白大部分是由核編碼的蛋白，這些蛋白是如何進(jìn)入線粒體，又是如何相互協(xié)調(diào)完成物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)木唧w機(jī)制目前尚不完全清楚。為了更好地獲得線粒體蛋白功能網(wǎng)，弄清整套線粒體蛋白組的調(diào)節(jié)系統(tǒng)已成為研究重點(diǎn)。在近年來，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在線粒體功能紊亂時，發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)確定有許多蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，包括MTs。相關(guān)研究顯示MTs可以降低線粒體功能紊亂，減輕線粒體損傷，其作用機(jī)制可能與MTs抗氧化損傷、抑制凋亡及金屬離子調(diào)節(jié)的功能有關(guān)。

3 MTs對線粒體功能的影響

3.1MTs與線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成 采用無細(xì)胞體系的研究發(fā)現(xiàn)MT-I作為ROS清除劑能有效抑制ROS引起的細(xì)胞毒性，MT-I+II表達(dá)缺失小鼠對阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低和ROS增多更敏感[14]，說明MTs具有清除ROS、減輕細(xì)胞損傷的作用。MTs作為一種有效的自由基清除劑，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能及時清除體內(nèi)因各種原因引起的自由基堆積，對維持機(jī)體的氧化還原平衡發(fā)揮重要作用。線粒體是ROS的生產(chǎn)中心，正常生理?xiàng)l件下機(jī)體內(nèi)ROS的生成與清除處于平衡狀態(tài)。當(dāng)線粒體受到應(yīng)激時將產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致線粒體功能紊亂及氧化還原反應(yīng)嚴(yán)重失衡。雖然MTs在線粒體中不表達(dá)，但在線粒體膜間隙中卻有大量分布，可以有效清除擴(kuò)散到線粒體膜間隙的ROS，防止ROS向細(xì)胞基質(zhì)中擴(kuò)散，對抑制線粒體內(nèi)膜蛋白及其它細(xì)胞器的氧化損傷起到重要作用[15]。

通過采用魚藤酮抑制線粒體復(fù)合物I活性誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多的研究發(fā)現(xiàn)，MT-IIA過表達(dá)的HeLa細(xì)胞存活率明顯高于野生型[7]，提示MTs除了清除ROS，還可能具有升高復(fù)合物I活性，抑制ROS生成的作用。有研究報道MTs在氧化應(yīng)激時可以通過改變核編碼的復(fù)合物IV亞基的修飾，增強(qiáng)復(fù)合物IV對氧的利用率[15]。因此，MTs可以通過對線粒體復(fù)合物活性和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)線粒體呼吸鏈對氧的利用率，抑制線粒體ROS的生成。

3.2MTs參與調(diào)節(jié)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是由多基因控制的有序性細(xì)胞自主死亡，是多細(xì)胞生物體發(fā)育和生存的自然生理現(xiàn)象。在線粒體功能紊亂和氧化應(yīng)激狀態(tài)下，產(chǎn)生大量的細(xì)胞凋亡啟動劑如ROS、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α等，使細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多。近年來研究顯示MTs具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，如Cai等[16]研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激作用下MT表達(dá)缺失小鼠的細(xì)胞凋亡率明顯高于正常細(xì)胞。其可能的作用機(jī)制與MTs抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。凋亡作為關(guān)鍵的細(xì)胞生理過程，其本身具有完善的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，涉及到多種基因和蛋白的調(diào)控，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如c-myc、抑癌基因p53等。MTs可以直接或間接調(diào)控細(xì)胞凋亡級聯(lián)系統(tǒng)，參與線粒體細(xì)胞凋亡通路的調(diào)節(jié)。研究顯示在細(xì)胞凋亡前期MTs可以減少線粒體細(xì)胞色素C釋放和抑制caspase-3活性，認(rèn)為主要是由Zn2+與MTs共同對caspase-3活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[17]。此外，研究報道MTs抑制細(xì)胞凋亡的過程與核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、腫瘤抑制蛋白(P53)、Bax和Bcl-2的調(diào)節(jié)有關(guān)。在氧化應(yīng)激下MTs可以抑制P38 MAPK、Bax和P53蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)和NF-κB活性，但是MTs對這些細(xì)胞因子的具體作用機(jī)制尚不清楚[18]。

3.3MTs對金屬離子和線粒體酶的調(diào)節(jié)作用 Zn2+和Cu2+是細(xì)胞內(nèi)多種酶類和轉(zhuǎn)錄因子的必須金屬離子，對細(xì)胞生命過程及信號通路的調(diào)節(jié)具有重要意義[19]。研究表明通過調(diào)節(jié)Zn2+含量可以抑制復(fù)合物III活性和細(xì)胞色素C釋放[20]。MTs具有高熱穩(wěn)定性，是Zn2+等金屬離子的高效螯合劑，對體內(nèi)Zn2+具有明顯調(diào)節(jié)作用。MTs通過將Zn2+和Cu2+等金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)給酶類、抗氧化因子和轉(zhuǎn)錄因子等參與細(xì)胞內(nèi)酶活性的調(diào)節(jié)。MTs對線粒體酶活性的調(diào)節(jié)與Zn2+有關(guān)，主要是通過轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+作用激活線粒體酶活性。研究發(fā)現(xiàn)從MT-/-小鼠心肌細(xì)胞提取的順烏頭酸酶無法與ZnCl2的Zn2+結(jié)合，但卻能夠與MT-II上結(jié)合的Zn2+發(fā)生作用[21]，提示Zn2+可能是通過MTs介導(dǎo)與線粒體順烏頭酸酶發(fā)生作用。其機(jī)制可能是Zn2+與低分子量的鋅離子配體如Zn7MT結(jié)合后，在氧化應(yīng)激或pH降低時，鋅離子配體通過線粒體內(nèi)膜的鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)與順烏頭酸酶結(jié)合[16, 22]。研究報道山梨糖醇脫氫酶使細(xì)胞質(zhì)合成并轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)，當(dāng)其進(jìn)入線粒體內(nèi)時構(gòu)型發(fā)生改變和輔助因子丟失，而MT-I/II可以傳遞Zn2+給山梨糖醇脫氫酶使其恢復(fù)活性[23]。因此，MTs雖然不能跨過線粒體內(nèi)膜，但MTs可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的方式，向線粒體復(fù)合物I～V、細(xì)胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶、賴氨酰氧化酶和多巴胺β羥化酶等酶類提供和運(yùn)送必需金屬，間接參與線粒體酶活性的調(diào)節(jié)[24]。

在氧化應(yīng)激作用下輔酶Q被氧化成泛半醌自由基，成為電子泄漏的主要位點(diǎn)。Ebadi等[25]研究顯示MTs可以誘導(dǎo)輔酶Q表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)元線粒體的功能。其可能機(jī)制是MTs通過與Zn2+結(jié)合降低Zn2+的濃度，從而激活硫辛酰胺脫氫酶促進(jìn)輔酶Q的合成[26]。因此，MTs的表達(dá)增高可以促進(jìn)輔酶Q的合成，提高線粒體對氧的利用率，降低自由基產(chǎn)生，對細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。

3.4MTs與谷胱甘肽循環(huán) 在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)的還原型谷胱甘肽(GSH)水平相對穩(wěn)定，是機(jī)體內(nèi)清除ROS的主要物質(zhì)之一，對維持機(jī)體氧化還原平衡具有重要作用。在氧化應(yīng)激時GSH嚴(yán)重耗竭，機(jī)體抗氧化劑嚴(yán)重不足，急需其它抗氧化劑的補(bǔ)充。此時，MTs可以在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下迅速表達(dá)上調(diào)成為機(jī)體主要的抗氧化劑，及時補(bǔ)充機(jī)體的抗氧化物，降低細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗，維持氧化還原平衡[16]。由于自由基的活性高且半衰期短，要求抗氧化物非常接近自由基產(chǎn)生的部位才能及時有效地將其清除。在缺乏MTs表達(dá)的線粒體基質(zhì)中，MTs無法直接清除線粒體內(nèi)的ROS，而是通過MTs-谷胱甘肽循環(huán)進(jìn)行清除。研究發(fā)現(xiàn)，MTs的β區(qū)域可以與谷胱甘肽結(jié)合，通過金屬離子的交換促進(jìn)氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH。因此MTs可以通過調(diào)節(jié)GSH/GSSG循環(huán)，提高線粒體抗氧化劑的含量，間接發(fā)揮保護(hù)線粒體氧化損傷的作用。MTs與GSSG結(jié)合后其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，MTs將Zn2+與GSSG Cu2+交換，同時MT-半胱氨酸殘基將GSSG還原成GSH，GSH被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)與自由基發(fā)生氧化反應(yīng)并釋放Zn2+[27]。由于Zn2+是線粒體酶活性的必需金屬離子，因此，MTs-谷胱甘肽循環(huán)對抑制線粒體氧化損傷、調(diào)節(jié)線粒體酶活性具有重要意義。

3.5MTs對線粒體能量代謝的影響 近年來研究提示，MTs可能在線粒體的能量代謝過程中發(fā)揮重要作用。Coyle等[28]報道MT-/-小鼠肝內(nèi)ATP的水平明顯降低。MT-/-小鼠具有肥胖和生長過速的趨勢，可能是MT-/-小鼠代謝率降低所致[29]。進(jìn)一步對MT-/-小鼠進(jìn)行生理生化檢測發(fā)現(xiàn)，肥胖基因表達(dá)、瘦素及肝臟的脂肪和脂質(zhì)含量均明顯增高，Cu2+含量明顯降低，葡萄糖、三酰甘油和胰島素的水平?jīng)]有明顯變化[29]。盡管MT-/-小鼠的肝臟Zn2+水平?jīng)]有明顯改變，但Rofe等[30]用內(nèi)毒素干預(yù)后MT-/-小鼠的肝和血液乳酸鹽的濃度明顯低于野生型小鼠，提示MTs表達(dá)缺失可以影響小鼠的能量代謝，但其具體作用機(jī)制還不清楚。研究顯示Zn2+和Cu2+對機(jī)體的新陳代謝具有調(diào)節(jié)作用，因此MTs是否通過對Zn2+和Cu2+的調(diào)節(jié)參與線粒體的能量代謝尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)MTs對羅哌卡因引起的心肌細(xì)胞ATP功能障礙具有緩解作用[31]。

3.6MTs對線粒體其它功能的影響 研究顯示MTs參與線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)，主要是涉及氧化磷酸化和分子代謝轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。MT-I作用于分離的大鼠肝細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)換孔張開，導(dǎo)致通透性增加、內(nèi)膜去極化和線粒體膨脹[33]。單獨(dú)采用Zn2+處理分離的大鼠肝細(xì)胞線粒體可以使轉(zhuǎn)換孔打開，但是心肌細(xì)胞線粒體中卻未產(chǎn)生變化[34]，其可能原因是在心肌細(xì)胞線粒體中無MTs介導(dǎo)Zn2+參與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)。MTs除了與金屬離子結(jié)合外，還可以與磷酸鹽形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)。Maret等[35]發(fā)現(xiàn)在體外MTs可以與嘌呤核苷酸磷酸鹽結(jié)合，如GTP和ATP，但MTs與ATP結(jié)合的親和力相對于其它受體來說是非常低的。還有研究提示MTs對mtDNA的表達(dá)和線粒體生成功能也可能具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是目前關(guān)于MTs對線粒體mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的報道相對較少，主要認(rèn)為MTs通過抗氧化應(yīng)激作用抑制DNA毒性和保護(hù)mtDNA的完整性[25, 36-37]。應(yīng)用心肌MTs特異性高表達(dá)小鼠研究表明，MTs可顯著抑制高脂引起的心肌線粒體生成改變，進(jìn)而抑制心肌功能紊亂和組織氧化損傷[16]。

4 MTs調(diào)節(jié)線粒體功能的可能作用機(jī)制

MTs通過多種途徑參與線粒體病理生理過的調(diào)節(jié)，對線粒體功能紊亂具有明顯的保護(hù)作用。其保護(hù)作用機(jī)制主要涉及到線粒體的氧化還原、呼吸鏈的電子傳遞、凋亡信號、酶活性、金屬離子、膜轉(zhuǎn)換孔、線粒體DNA及線粒體生成等功能的調(diào)節(jié)[27]。目前的研究結(jié)果顯示MTs可能主要通過以下途徑發(fā)揮對線粒體功能的保護(hù)作用：(1)金屬硫蛋白作為一種抗氧化蛋白，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，通過清除線粒體ROS，維持線粒體代謝過程中氧化還原平衡，抑制線粒體和mtDNA氧化損傷和細(xì)胞凋亡;(2)MTs富含鋅離子且具有較高的親和力，通過MTs-谷胱甘肽的還原反應(yīng)和金屬離子循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，調(diào)節(jié)線粒體酶的活性；(3)對線粒體呼吸鏈復(fù)合物的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)復(fù)合物I和IV對氧的利用率，抑制ROS的生成;(4)MTs對線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)Zn2+進(jìn)入線粒體激活順烏頭酸酶，順烏頭酸酶進(jìn)一步催化檸檬酸酶轉(zhuǎn)化為異檸檬酸酶，促進(jìn)三羧酸循環(huán)；(5)MT對線粒體生成功能的調(diào)節(jié)作用。MTs表達(dá)增高可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激因子-1α(PGC-1α)表達(dá)及功能的活化，而PGC-1α是線粒體生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，具有促進(jìn)線粒體生成的作用。Dong等[38]研究發(fā)現(xiàn)MTs具有抗高脂飲食導(dǎo)致的心功能障礙作用，其主要機(jī)制可能與MTs調(diào)節(jié)PGC-1α及下游的調(diào)控因子NRF-1/2和mtTFA表達(dá)，促進(jìn)線粒體生成有關(guān)。這些研究提示，MT有可能通過多種機(jī)制影響線粒體功能。

5 展望

金屬硫蛋白作為多功能應(yīng)激蛋白，其清除自由基、重金屬解毒和維持金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)功能已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同。盡管MTs的物理、化學(xué)及遺傳特性已經(jīng)比較清楚，但其確切的生理功能仍有待于進(jìn)一步研究。隨著研究的深入，越來越多的研究顯示金屬硫蛋白可通過多種途徑參與線粒體功能的調(diào)節(jié)，對減輕線粒體損傷和促進(jìn)線粒體損傷修復(fù)具有重要作用。但目前關(guān)于MTs與線粒體功能的關(guān)系研究報道仍比較少，其具體的作用機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。深入了解MTs對線粒體功能的影響及其機(jī)制，對于相關(guān)線粒體疾病的預(yù)防和治療將具有重要的意義。

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