黃兆峰， 周欣欣， 黃紅娟， 魏守輝， 陳景超， 楊 龍， 陳金奕， 張朝賢

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100193)

草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，是國(guó)內(nèi)外防除一年生及多年生雜草的主要藥劑[1-6]。草甘膦的作用機(jī)制是抑制植物體內(nèi)5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的活性，導(dǎo)致莽草酸大量積累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，進(jìn)而擾亂正常的氮代謝[7]。以往研究表明：植物體內(nèi)EPSPS基因的過量表達(dá)可以有效提高其對(duì)草甘膦的耐藥性[8-11]。

田旋花(ConvolvulusarvensisL.)屬旋花科，是一種多年生惡性雜草，其繁殖和再生能力極強(qiáng)，是華北地區(qū)小麥、玉米、大豆等旱作物田的重要雜草[12]。已被世界糧農(nóng)組織列為世界上18種危害最嚴(yán)重的雜草之一[13]。DeGennaro等研究發(fā)現(xiàn)，無草甘膦用藥史的田旋花對(duì)草甘膦具有天然的耐藥性[14]；劉延等發(fā)現(xiàn)，北京房山麥田田旋花對(duì)草甘膦具有較高的耐藥性，并首次克隆了田旋花EPSPS基因(GenBank登錄號(hào)：EU698030)[12]；張猛比較了不同田旋花種群的耐藥性水平，提出草甘膦處理后的EPSPS基因在表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量上的差異是其對(duì)草甘膦產(chǎn)生耐藥性差異的一個(gè)重要因素[13]。

本試驗(yàn)利用染色體步移技術(shù)克隆了田旋花EPSPS基因的啟動(dòng)子序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。用該啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因連接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，花序侵染法侵染擬南芥，獲得轉(zhuǎn)EPSPS-P啟動(dòng)子擬南芥，為進(jìn)一步了解田旋花EPSPS基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 田旋花種子采自北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)；擬南芥種子由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株 大腸桿菌DH5α購(gòu)自全式金公司；質(zhì)粒pBI121、農(nóng)桿菌GV3101由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所晁躍輝博士惠贈(zèng)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 Genome Walking Kit，T4連接酶，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ，PMD19-T載體，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 取田旋花新鮮葉片，用CTAB方法提取總DNA，作為克隆田旋花EPSPS基因啟動(dòng)子的模板。產(chǎn)物濃度和純度用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，同時(shí)在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)DNA的完整性，以進(jìn)一步確定DNA的質(zhì)量。

1.2.2 啟動(dòng)子克隆 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的田旋花EPSPS核苷酸序列設(shè)計(jì)3條特異引物：GW-1：5′-AGAGAGATTGCTGGGGCTCAAACGC-3′；GW-2：5′-GAGGTTTAGAGAGATTGCTGGGGCT -3′；GW-3：5′-CCCACCAAATTCAATTAAGAGGTTT-3′。 引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。

根據(jù)Genome Walking Kit的說明，采用3輪嵌套式反應(yīng)程序。在第1輪反應(yīng)中，分別以AP1、AP2、AP3為上游引物，GW-1為下游引物，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s、25 ℃ 3 min、72 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、44 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，將上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍用作第2輪PCR擴(kuò)增的模板，第2輪PCR反應(yīng)分別以AP1、AP2、AP3為上游引物，GW-2為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、94 ℃ 30 s、44 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。第3輪PCR反應(yīng)分別以AP1、AP2、 AP3為上游引物，GW-3為下游引物，反應(yīng)程序與第2輪反應(yīng)一致。所得最終PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過膠回收純化后與 pMD19-T 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列的生物信息學(xué)分析 將測(cè)序結(jié)果在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。同時(shí)在PlantCARE (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，分析存在的TATA-box、CAAT-box以及其他作用元件。

1.2.4EPSPS-P啟動(dòng)子和GUS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已得到的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)2條特異性引物：EPS-P-F：5′-AAGCTTAAACCTCTTAATTGAAT-3′(含HindⅢ酶切位點(diǎn))和EPS-P-R：5′-TCTAGAGGTATTTTAAAAGAGGC-3′(含XbaⅠ酶切位點(diǎn))，將PMD- EPSPS-P、pBI121分別用限制性內(nèi)切酶HindⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收啟動(dòng)子片段，然后用T4酶連接至酶切后的pBI121中。使EPSPS-P替換pBI121中的35S啟動(dòng)子，得到EPSPS-P與載體中GUS報(bào)告基因相連的雙元表達(dá)載體pBI-EPSPS-P。采用氯化鈣凍融法將pBI-EPSPS-P導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性檢測(cè)[15]將轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片用無菌水沖洗干凈后放入GUS染液中，抽真空至材料表面產(chǎn)生少許氣泡并被染液完全淹沒為止，37 ℃過夜，用脫色液脫色后在體視顯微鏡下觀察染色結(jié)果。GUS染液配方：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值7.0)，5 mmol/L鐵氰化鉀，5 mmol/L 亞鐵氰化鉀，0.1% Triton X-100，1 mmol/L X-Gluc。脫色液配方：乙醇 ∶乙酸=3 ∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPSPS-P啟動(dòng)子片段的獲得

利用染色體步移方法，通過3輪PCR擴(kuò)增，得到了長(zhǎng)約1.2 kb的DNA片段，將得到的大片段回收、測(cè)序，結(jié)果顯示，該DNA片段長(zhǎng)1 145 bp，排除與已知的田旋花EPSPS基因序列重疊部分，實(shí)際獲得的啟動(dòng)子片段為1 142 bp(圖1)，可以看出該序列富含A/T，是啟動(dòng)子序列的重要特征之一。

2.2 啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

通過PlantCARE對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)表明，EPSPS-P啟動(dòng)子序列中含有典型的啟動(dòng)子基本元件，如TATA-box 和CAAT-box，其中TATA-box(RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn))位于起始密碼子ATG上游-40～-36。TATA-box近端的1個(gè)脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats區(qū)位于-692～-683；此外，還有與光效應(yīng)有關(guān)的元件 Sp1、GATA-motif，以及生理節(jié)奏控制元件circadian，該EPSPS基因啟動(dòng)子GenBank的登錄號(hào)為KC107822。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將含有啟動(dòng)子的pMD19-T質(zhì)粒和pBI121的載體分別用HindⅢ、XbaⅠ雙酶切，電泳圖譜結(jié)果見圖3-A；回收啟動(dòng)子片段，然后用T4連接酶連接至酶切后的pBI121上，經(jīng)酶切鑒定(圖3-B)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增，初步鑒定基因已連接于載體上。挑選陽(yáng)性菌落搖菌并提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到的目的片段大小與預(yù)測(cè)一致。經(jīng)測(cè)序表明，得到的序列完全正確，植物表達(dá)載體pBl121-EPSPS-P構(gòu)建成功。用凍融法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體PBl121-EPSPS-P導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取陽(yáng)性菌落搖菌，提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行雙酶切鑒定，得到2個(gè)條帶，且大小與預(yù)期一致，說明植物表達(dá)載體pBl121-EPSPS-P已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。用花序浸染法侵染擬南芥花序，收獲種子后在含50 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選抗性苗，挑取抗性苗移栽至花盆中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定與GUS活性檢測(cè)

為了檢測(cè)EPSPS-P啟動(dòng)子是否轉(zhuǎn)入擬南芥中，分別提取轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示均呈陽(yáng)性，而野生型(WT)無特異性條帶(圖4)。此外。對(duì)WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，由圖5可以看出，染色后WT無色，而轉(zhuǎn)基因擬南芥呈藍(lán)色。表明EPSPS-P已成功轉(zhuǎn)化到擬南芥中，并能啟動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

本研究采用染色體步移技術(shù)，通過3輪嵌套式PCR，克隆到長(zhǎng)度為1 142 bp的田旋花EPSPS基因啟動(dòng)子片段，用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件PlantCARE對(duì)該啟動(dòng)子片段進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該片段除了具有啟動(dòng)子保守元件TATA-box及CAAT-box外，還有其他一些作用元件，如TC-rich repeats(脅迫響應(yīng)元件)、spl(光響應(yīng)元件)、GATA-motif(光響應(yīng)元件)、CCAAT-motif(MYBHvl binding site)等。研究表明，EPSPS主要分布在葉綠體中[16-17]，而葉綠體是光合作用的主要場(chǎng)所。在對(duì)陸地棉的研究中發(fā)現(xiàn)，EPSPS基因在其成熟葉片中表達(dá)量最高[18]。通過對(duì)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，田旋花EPSPS啟動(dòng)子含有2個(gè)光響應(yīng)原件，這與EPSPS的分布和表達(dá)特征相符合。

很多化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)植物的影響都是通過直接或間接地作用于植物的啟動(dòng)子而調(diào)控植物基因的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖，以及植物對(duì)內(nèi)外環(huán)境的反應(yīng)[19]。以往的研究表明，田旋花在噴施草甘膦后，EPSPS基因在轉(zhuǎn)錄水平明顯提高[14]。因此筆者從田旋花EPSPS基因啟動(dòng)子入手，克隆并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到了轉(zhuǎn)EPSPS-P擬南芥，為進(jìn)一步探究田旋花耐藥性機(jī)制，以及EPSPS基因的表達(dá)調(diào)控提供了試驗(yàn)依據(jù)。

啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)需要多個(gè)順式元件，這些元件的種類、數(shù)量及彼此之間的順序與距離，都可能影響基因的轉(zhuǎn)錄與否或轉(zhuǎn)錄水平[20]。目前，缺失分析法是研究啟動(dòng)子功能的一種重要的方法。通過5′缺失法獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，分別與GUS報(bào)告基因融合構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥，對(duì)田旋花EPSPS基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性進(jìn)行研究，從而明確其在草甘膦等處理?xiàng)l件下的調(diào)控元件，將是下一步的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

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