楊鑫浩，李香菊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆是種植規(guī)模最大的的轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物，2012年種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的52%[1]。大部分商業(yè)化種植的耐草甘膦大豆轉(zhuǎn)入的是cp4-epsp基因，該基因的轉(zhuǎn)入，使大豆對草甘膦具有耐受性，所以田間可以噴施滅生性藥劑草甘膦除草[2]。草甘膦是一種非選擇性、傳導(dǎo)型莖葉處理除草劑，其作用機(jī)理是競爭性抑制莽草酸合成途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)與底物莽草酸-3-磷酸(S3P)的結(jié)合，導(dǎo)致植物體內(nèi)的莽草酸過量積累，阻斷植物芳香族氨基酸的生物合成，最終殺死植物[3]。國內(nèi)外研究表明，噴施草甘膦后，植物體內(nèi)莽草酸含量升高，因此，莽草酸積累是植物經(jīng)草甘膦處理后最早出現(xiàn)的且相對敏感的生理指標(biāo)[4-5]；陳景超等報(bào)道，施用草甘膦后雜草植株體內(nèi)莽草酸積累量可以反映不同雜草對草甘膦的敏感性，莽草酸積累量越多，植株對草甘膦耐受性越差[6]。國外對耐草甘膦大豆的研究發(fā)現(xiàn)，用1/4～1/2草甘膦推薦劑量進(jìn)行處理，耐草甘膦大豆體內(nèi)莽草酸無明顯積累[7-8]。但是，對使用高劑量草甘膦處理后耐草甘膦大豆體內(nèi)莽草酸含量的變化情況國內(nèi)外少有研究。生產(chǎn)中，草甘膦噴施劑量往往會超過推薦劑量，農(nóng)民甚至使用 2～3 倍推薦劑量局部定向噴霧。因此，研究高劑量草甘膦處理后耐草甘膦大豆體內(nèi)莽草酸含量的變化及草甘膦對大豆產(chǎn)量的影響更具有實(shí)際意義。06-698 是我國選育的耐草甘膦大豆，有較高增產(chǎn)潛力[9]；MON87701RR2Y為美國孟山都公司選育的耐草甘膦品種，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗除草劑、抗蟲特性，這2種耐草甘膦大豆均通過轉(zhuǎn)入cp4-epsp基因而對草甘膦產(chǎn)生耐受性。本試驗(yàn)通過研究耐草甘膦大豆噴施不同劑量草甘膦后葉片莽草酸含量的變化，其一，明確莽草酸積累量與大豆對草甘膦耐受性的關(guān)系；其二，通過草甘膦使用量與不同大豆材料莽草酸積累量的關(guān)系研究，試圖建立一種大豆對草甘膦耐受性評價(jià)的早期、快速、不破壞植株的方法，為我國耐草甘膦大豆的商業(yè)化種植提供數(shù)據(jù)支撐

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆材料：耐草甘膦大豆06-698和MON87701RR2Y均轉(zhuǎn)入cp4-epsp基因，對照分別為常規(guī)大豆材料綏農(nóng)14和A5547。上述材料中 06-698 由內(nèi)蒙古呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，綏農(nóng)14由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化農(nóng)科所提供，MON87701RR2Y和A5547由美國孟山都公司提供。

儀器及噴霧器械：FA1104 電子分析天平(上海天平儀器廠)；5417R型低溫臺式離心機(jī)(德國艾本德公司)；紫外-可見分光光度計(jì) UV2102 C型[優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司]；ASS-4型行走式噴霧塔(國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心)；CO2背負(fù)式噴霧器(國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心)。

試劑及藥品：莽草酸(Sigma 公司標(biāo)樣)；0.1 mol/L 甘氨酸；0.25 mol/L HCl(北京化工廠分析純)；1%HIO4(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所分析純)；41%草甘膦異丙胺鹽水劑(孟山都公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 網(wǎng)室試驗(yàn)及田間試驗(yàn)

1.2.1.1 網(wǎng)室試驗(yàn) 取未使用除草劑的農(nóng)田表層土壤過2 mm篩，按3 ∶1混入凱茵營養(yǎng)土(有機(jī)質(zhì)含量≥15%，N、P、K總含量≥0.88%，pH值7.0～7.5)，定量裝入直徑為15 cm的塑料花盆中，加水使土壤含水量為30%。每盆播種10粒大豆種子，播深3.0 cm，播種后將花盆置溫室(20±5)℃下培養(yǎng)。分別于大豆3、5、7張羽狀三出復(fù)葉期(3、5、7葉期)置ASS-4型行走式噴霧塔內(nèi)，噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑，劑量分別為615.0、1 230.0、2 460.0、3 690.0、4 920.0 g a.i./hm2，即1/2、1倍、2倍、3倍、4倍推薦劑量，記為X/2、X、2X、3X、4X，另設(shè)清水對照(CK)，其中1 230.0 g a.i./hm2為推薦劑量，每處理重復(fù)3次。

1.2.1.2 田間試驗(yàn) 于2012年5—11月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊中試基地暨農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督試驗(yàn)測試中心(北京)試驗(yàn)隔離區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)地為中壤，pH值為8.0，試驗(yàn)過程中的管理?xiàng)l件及安全措施按NY/T719.3—2003《轉(zhuǎn)基因大豆環(huán)境安全檢測技術(shù)規(guī)范 第3部分：對生物多樣性影響的檢測》進(jìn)行。試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積20 m2。大豆條播，行距40 cm，株距8 cm，出苗后按常規(guī)方式進(jìn)行田間管理，全小區(qū)均為人工除草。

分別于大豆3、5、7葉期用CO2背負(fù)式噴霧器噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑，劑量分別為0、615.0、1 230.0、2 460.0、3 690.0、4 920.0 g a.i./hm2。

1.2.2 取樣方法及莽草酸測定 大豆噴施草甘膦后1、3、5、7、9、11 d從每株大豆上剪取一小部分三出復(fù)葉，用液氮研磨葉片，稱取磨碎的樣品0.2 g于2.0 mL的離心管中，加入1.0 mL 0.25 mol/L HCl，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清液，4 ℃冰箱保存待測。

參考Gaitonde等的方法[10-11]，取200 μL上清液，加入2.0 mL 1% HIO4溶液，室溫靜置3 h，加入2.0 mL 1.0 mol/L NaOH并混勻；然后加入1.2 mL 0.1 mol/L甘氨酸，混勻，靜置5 min，于紫外分光光度計(jì)380 nm比色，記錄D。每處理重復(fù)3次，并重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.3 大豆生長狀況觀察及產(chǎn)量測定 田間試驗(yàn)在大豆施藥后1～14 d目測大豆長勢長相，收獲時(shí)每小區(qū)取2行大豆植株，晾干至籽粒含水量14%以下，測籽粒產(chǎn)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS軟件進(jìn)行分析處理，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦不同劑量對大豆葉片中莽草酸積累量的影響

網(wǎng)室試驗(yàn)結(jié)果表明，于大豆3葉期時(shí)噴施 1 230.0 g a.i./hm2草甘膦后，綏農(nóng)14和A5547常規(guī)大豆葉片內(nèi)即出現(xiàn)莽草酸積累，且其積累量隨用藥后時(shí)間的推移逐漸增加，分別在藥后3、5 d時(shí)達(dá)到峰值，即為2 561.54、2 565.38 μg/g，是處理前的7.17、7.47倍(圖1-A)。隨著草甘膦用量的增加，上述大豆材料葉片內(nèi)莽草酸積累量增加，即當(dāng)施藥劑量為 2 460.0 g a.i./hm2時(shí)，藥后3、5 d，大豆葉片莽草酸積累量分別為4 830.77、3 415.38 μg/g(圖1-B)。

草甘膦施藥量為1 230.0～3 690.0 g a.i./hm2時(shí)，藥后1～9 d，耐草甘膦大豆 06-698體內(nèi)莽草酸積累量與清水對照相比沒有明顯變化(圖2-A)，MON87701RR2Y也表現(xiàn)同樣趨勢，即噴施草甘膦處理與清水對照莽草酸積累差異不顯著(圖2-B)。用4倍推薦劑量草甘膦處理06-698和MON87701RR2Y后1 d，大豆葉片中莽草酸有一定程度積累，積累量分別為435.26、433.97 μg/g，是處理前的1.41、1.84倍，之后上述材料大豆葉片莽草酸積累量逐漸下降；至藥后9 d，兩材料葉片內(nèi)莽草酸的積累量與藥前相比差異不顯著(圖2)。田間試驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)室試驗(yàn)相近，即2個(gè)耐草甘膦大豆材料在草甘膦施藥量為X～3X時(shí)，莽草酸積累量與清水對照差異不顯著，草甘膦施藥量為4X時(shí)，莽草酸積累量在藥后1～3 d升高，之后與清水對照差異不顯著。

2.2 不同葉齡噴施草甘膦后大豆體內(nèi)莽草酸積累量的變化

在網(wǎng)室盆栽試驗(yàn)中，分別在大豆06-698的3、5、7葉期噴施4 920.0 g a.i./hm2草甘膦，隨后研究該大豆材料葉片中莽草酸積累量的變化情況，結(jié)果見圖3-A。由此可看出，3葉期施用草甘膦的大豆莽草酸積累量與5、7葉期施用草甘膦的大豆相比偏高。但方差分析結(jié)果表明，不同葉期施藥，大豆葉片莽草酸積累量差異不顯著。MON87701RR2Y也表現(xiàn)同樣趨勢(圖3-B)。

由圖4可知，田間條件下分別于3、5、7葉期對耐草甘膦大豆06-698和MON87701RR2Y噴施 4 920.0 g/hm2草甘膦后，其葉片中莽草酸積累量的變化趨勢與網(wǎng)室盆栽試驗(yàn)中的相近，說明在供試的不同葉齡期噴施4 920.0 g/hm2草甘膦并未使耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量發(fā)生顯著變化。噴施其他低劑量草甘膦后，耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量的變化趨勢相同。但是，田間試驗(yàn)測得的耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量和莽草酸峰值出現(xiàn)的時(shí)間與網(wǎng)室盆栽試驗(yàn)略有差異，這可能與田間較為復(fù)雜的環(huán)境條件有關(guān)。

2.3 噴施草甘膦對大豆產(chǎn)量的影響

由表1可以看出，在3～7葉期噴施不同劑量草甘膦后，06-698和MON87701RR2Y耐草甘膦大豆產(chǎn)量與對照差異不顯著(P>0.05)。說明耐草甘膦大豆噴施草甘膦后，若葉片莽草酸積累量與對照差異不顯著，則噴施草甘膦不會造成減產(chǎn)；噴施較高劑量草甘膦后，雖然大豆葉片莽草酸積累量前期有一定增加，但如果莽草酸短期能夠恢復(fù)至藥前水平，則大豆產(chǎn)量也不會受到影響。常規(guī)大豆在噴施X劑量草甘膦后，莽草酸積累量急劇增加且一直維持在較高水平，藥后2周內(nèi)基本死亡，無經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

表1 不同葉齡期噴施草甘膦對耐草甘膦大豆產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與討論

網(wǎng)室盆栽和田間條件下用草甘膦處理耐草甘膦大豆和常規(guī)大豆，這2種大豆葉片中莽草酸積累量差異顯著。與不用藥空白對照相比，用1 230.0～2 460.0 g a.i./hm2草甘膦處理后的耐草甘膦大豆06-698、MON87701葉片莽草酸積累量均未顯著增加，而常規(guī)大豆綏農(nóng)14和A5547葉片中的莽草酸積累量在1 230.0、2 460.0 g a.i./hm2草甘膦處理下急劇增加，之后一直保持在很高水平直至枯萎死亡。田間條件下的試驗(yàn)結(jié)果與盆栽結(jié)果相一致，這是因?yàn)槭荏w大豆綏農(nóng)14、A5547在噴施草甘膦后，其EPSPS酶受到抑制，導(dǎo)致莽草酸大量積累，而 06-698 和MON87701RR2Y則由于轉(zhuǎn)入了不敏感的epsp基因使得芳香族氨基酸的合成繼續(xù)進(jìn)行，體內(nèi)莽草酸積累量基本沒有變化。這與Singh等報(bào)道的“普通大豆草甘膦處理后莽草酸積累量快速增加，而耐草甘膦大豆莽草酸積累量在低劑量307.5 g a.i./hm2草甘膦處理下基本不變”的結(jié)論[8]一致。

盆栽試驗(yàn)中耐草甘膦大豆MON87701RR2Y和06-6983在不同葉齡期噴施615.0～3 690.0 g a.i./hm2草甘膦，其葉片莽草酸積累量基本沒有變化，表現(xiàn)出對草甘膦很強(qiáng)的耐受性。在 4 920.0 g a.i./hm2草甘膦處理下，這2種大豆在藥后1～3 d出現(xiàn)莽草酸短暫積累峰值，但很快趨于平穩(wěn)，這期間目測到大豆葉片有發(fā)黃現(xiàn)象，之后隨大豆生長癥狀逐漸緩解。田間條件下的試驗(yàn)結(jié)果與盆栽試驗(yàn)莽草酸變化趨勢相同，但田間試驗(yàn)條件下的大豆在不同葉齡期施藥后，葉片莽草酸最大積累值出現(xiàn)的時(shí)間偏晚于盆栽試驗(yàn)，莽草酸總積累量也略有差異，這可能與田間復(fù)雜而多變的環(huán)境有關(guān)，如干旱，高溫均會對耐草甘膦大豆體內(nèi)EPSPS酶表達(dá)產(chǎn)生影響，從而影響莽草酸的積累[12-13]。盆栽及田間試驗(yàn)結(jié)果均顯示，耐草甘膦大豆在3～7葉期對草甘膦耐受性沒有明顯差異，均表現(xiàn)出對1、2倍推薦劑量草甘膦很強(qiáng)的耐受性和對4倍推薦劑量草甘膦較強(qiáng)的耐受性，大豆測產(chǎn)結(jié)果也表明不同時(shí)期施藥和不同處理劑量下的大豆產(chǎn)量與空白對照差異不顯著。

本試驗(yàn)以施用草甘膦后大豆葉片莽草酸積累量為指標(biāo)，對大豆耐草甘膦的程度進(jìn)行研究，結(jié)果表明，施用草甘膦后，可以通過測定大豆葉片的莽草酸積累量來評估大豆對草甘膦的耐受性，其測定時(shí)間以藥后3～5 d為宜。如果藥后3～5 d，大豆葉片中莽草酸積累量與不用藥空白對照差異不顯著，則表明該大豆材料對草甘膦有較好的耐受性。以往主要采用生物測定方法來測定作物對草甘膦的耐受性，即在作物生長期噴施不同劑量草甘膦，以作物的株高、鮮質(zhì)量等生物學(xué)指標(biāo)的受抑制程度來判定其對草甘膦的耐受性，但這種方法歷時(shí)較長，得出結(jié)論較晚；而且株高、鮮質(zhì)量等指標(biāo)常受環(huán)境的影響，造成個(gè)體生長量的差異。莽草酸積累量的測定，將為大豆的草甘膦耐受性檢測提供一種簡便、易行和不破壞整株植物的耐受性測定方法，對準(zhǔn)確評價(jià)大豆對草甘膦的耐受性有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]James C. Highlights of global status of commercialized biotech/GM crops[R]. New York：ISAAA，2012.

[2]宋 敏，劉麗軍，蘇穎異，等. 抗草甘膦EPSPS基因的專利保護(hù)分析[J]. 中國生物工程雜志，2010，30(2)：147-152.

[3]Amrhein N，Deus B，Gehrke P，et al. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate.Ⅱ. Interference of glyphosate with chorismate formationinvivoandinvitro[J]. Plant Physiology，1980，66(5)：830-834.

[4]Pline W A，Wilcut J W，Duke S O，et al. Tolerance and accumulation of shikimic acid in response to glyphosate applications in glyphosate-resistant and nonglyphosate-resistant cotton(GossypiumhirsutumL.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(3)：506-512.

[5]Lorraine-Colwill D F，Hawkes T R，Williams P H，et al. Resistance to glyphosate in Lolium rigidum[J]. Pesticide Science，1999，55(4)：489-491.

[6]陳景超，張朝賢，黃紅娟，等. 三種雜草對草甘膦的敏感性及處理后植株體內(nèi)莽草酸積累量差異[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(5)：471-474.

[7]Henry W B，Koger C H，Shaner D L. Accumulation of shikimate in corn and soybean exposed to various rates of glyphosate[J]. Crop management，2005，4(1)：1-6.

[8]Singh B K，Shaner D L. Rapid determination of glyphosate injury to plants and identification of glyphosate-resistant plants[J]. Weed Technology，1998，12(3)：527-530.

[9]曹洪玉，李香菊，劉士陽，等. 草甘膦水劑在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆田除草效果及安全性研究[J]. 雜草科學(xué)，2011，29(3)：22-25.

[10]Gaitonde M K，Gordon M W. A microchemical method for the detection and determination of shikimic acid[J]. Journal of Biological Chemistry，1958，230(2)：1043-1050.

[11]婁遠(yuǎn)來，鄧淵鈺，沈晉良，等. 甲磺隆和草甘膦對空心蓮子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32(2)：185-188.

[12]李昌曉，鐘章成，陶建平.不同水分條件下池杉幼苗根系的蘋果酸、莽草酸含量及生物量[J]. 林業(yè)科學(xué)，2008，44(10)：1-7.

[13]原向陽，郭平毅，張麗光，等. 干旱及復(fù)水條件下草甘膦對抗草甘膦大豆幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和莽草酸含量的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26(7)：1075-1081.