黃東杰等

摘 要 利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化子連續(xù)轉(zhuǎn)接5代能夠穩(wěn)定遺傳，熒光強(qiáng)度良好，PCR驗(yàn)證gfp基因已轉(zhuǎn)入到菌株中，為后續(xù)研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可視化的檢測(cè)和分析手段。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴?；?；尖孢鐮刀菌萎蔫?；?；綠色熒光蛋白 ；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

分類號(hào) Q78

Abstract Several Fusarium oxysporum strains （Foc1， Foc4， Foc 8359#， Foc 8361#， Foc 8363#， Foc 8368# and Fov） have been successfully transformed with the gene coding for green fluorescent protein （GFP） using protoplast transformation method mediated by PEG. Transformants can emit quite stable fluorescence under 480 nm laser after five successive subcultures. PCR analysis confirmed that the gfp gene had been transformed into F. oxysporum strains. Those GFP transformations of F. oxysporum will provide a visible material for the study of infection and control of fusarium wilt of banana and cotton.

Keywords Fusarium oxysporum f. sp. Cubence ； Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum ； green fluorescent protein ； protoplast transformation

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、黃葉病，是由半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubence， Foc）引起的土傳維管束病害[1]。2007年5月中國(guó)將香蕉枯萎病列入進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄[2]。目前發(fā)現(xiàn)該病菌有4個(gè)生理小種，其中，4號(hào)小種危害最大，是目前香蕉病害中最難防治的病害，危害大蜜哈（AAA）、香牙蕉（AAA）、Taiwan Latundan（AAB）、Pisang Lilin（AA）、野蕉（BB）和Silk（AAB）等[3]。

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫專化型（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum， Fov） 引起的棉花土傳維管束病害，是一種對(duì)棉花危害性較大的病害，同時(shí)也是一種世界性棉花病害，在中國(guó)湖北、新疆棉區(qū)發(fā)生較普遍，發(fā)病嚴(yán)重的田塊，可以造成毀滅性的損失。發(fā)病植株葉片發(fā)黃或呈現(xiàn)紫外線斑，葉脈也變成紫紅色；有的病株葉脈變黃成為網(wǎng)狀；病株在雨后初晴時(shí)出現(xiàn)急性病癥，全株萎蔫下垂枯死，或整株半邊葉子變黃，并逐漸枯萎脫落成光稈而死。無論哪種癥狀類型，剖開棉株莖稈，輸導(dǎo)組織都變?yōu)樯詈稚玔4]。

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）自1962年從發(fā)光水母（A. victoria）中被發(fā)現(xiàn)以來，已作為報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用[5]。GFP本身即為發(fā)光蛋白，熒光性穩(wěn)定、直觀，操作方便，不添加任何外源底物就可以在活體細(xì)胞中觀察和進(jìn)行定位檢測(cè)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)報(bào)告基因的不足。本文利用攜帶gfp基因的pCT74質(zhì)粒，采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化6株來自不同地區(qū)的香蕉枯萎病菌（Foc）和1株棉花枯萎病菌（Fov）。香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌均為尖孢鐮刀菌，均危害宿主維管束，為便于今后研究尖孢鐮刀菌的共性致病機(jī)制，對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行GFP標(biāo)記。6株香蕉枯萎病菌來自不同的國(guó)家和地區(qū)，或?qū)儆诓煌硇》N，對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行GFP標(biāo)記有助于今后進(jìn)行致病力差異研究。本研究將為后續(xù)枯萎病菌侵染機(jī)理和宿主抗病機(jī)理的研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

香蕉枯萎病菌（尖孢鐮刀菌古巴?；?，F(xiàn)usarium oxysporum f. sp. cubence， Foc） Foc1、Foc4及（Fov）由本實(shí)驗(yàn)室保存；Foc 8359# （澳大利亞）、Foc 8361#（澳大利亞）、Foc 8363#（馬來西亞）、Foc 8368# （臺(tái)灣）來自香港浸會(huì)大學(xué)。

pCT74質(zhì)粒，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所農(nóng)業(yè)微生物研究中心肖榮鳳惠贈(zèng)，含有真菌P.triticirepentis的ToxA啟動(dòng)子和潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygr）[6]。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒提取

質(zhì)粒DNA提取按Plasmid Mini Kit（QIAGEN）試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 原生質(zhì)體制備

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調(diào)整。具體如下：① 從培養(yǎng)皿上挑取少量菌絲于盛有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28或30℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。然后用3層擦鏡紙過濾，獲得孢子懸液，濃度約107 spores/mL。② 吸取1～2 mL孢子懸液到含100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h。③ 以3層擦鏡紙過濾，收集菌絲，再用2 mL NaCl溶液洗滌3次。④ 將菌絲置于50 mL離心管中，加入裂解液（每克菌絲加約3.5 mL），28℃，70 r/min振蕩消化3 h。⑤ 以3層擦鏡紙過濾，將濾液室溫5 000 r/min離心10 min；棄上清，加40 mL STC溶液，5 000 r/min離心10 min。⑥ 棄上清，沉淀用適量STC溶液（200～400 μL）溶解[（原生質(zhì)體濃度約為（1-9）×107 spores/mL）]。endprint

1.2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調(diào)整。具體如下：于200 μL原生質(zhì)溶液中加40 μL pCT74質(zhì)粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上；28℃，倒置培養(yǎng)，7～10 d后可獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的熒光穩(wěn)定性分析及PCR檢測(cè)

挑取半固體再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下觀察檢測(cè)，以可見光下的觀察作為對(duì)照。將能夠觀察到綠色熒光的轉(zhuǎn)化子繼代培養(yǎng)5代后，進(jìn)行熒光穩(wěn)定性分析和菌落PCR檢測(cè)。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察。

2.2 轉(zhuǎn)化子熒光穩(wěn)定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化子在無篩選壓力的培養(yǎng)基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長(zhǎng)良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉(zhuǎn)化子gfp基因已被轉(zhuǎn)入到菌株中，性狀穩(wěn)定。

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)

對(duì)繼代5次的轉(zhuǎn)化子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增包含325 bp的啟動(dòng)子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區(qū)[8]，進(jìn)一步說明該gfp基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到菌株中，并具良好的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

GFP被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌研究，可作為報(bào)告基因進(jìn)行定位及定性檢測(cè)，此外在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、突變體致病力、蛋白表達(dá)、真菌與宿主相互作用、真菌環(huán)境生態(tài)學(xué)等研究中均有應(yīng)用[9]。本研究中獲得的轉(zhuǎn)化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發(fā)出極強(qiáng)的綠色熒光，說明gfp基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到菌株中，同時(shí)繼代5次后的轉(zhuǎn)化子也能經(jīng)過PCR檢測(cè)到gfp基因片段。

原生質(zhì)體的制備是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵[10]，利用孢子懸浮液培養(yǎng)12 h，得到的菌絲均為幼潤(rùn)的新鮮菌絲，且新鮮程度相對(duì)一致，易于原生質(zhì)體的制備，與肖榮鳳等[6]結(jié)果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長(zhǎng)方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉(zhuǎn)入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉(zhuǎn)化子具備較好的穩(wěn)定性。本研究所獲得的轉(zhuǎn)化菌株將被應(yīng)用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測(cè)和分析手段。

致 謝 感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所農(nóng)業(yè)微生物研究中心肖榮鳳轉(zhuǎn)贈(zèng)pCT74質(zhì)粒及其在菌株轉(zhuǎn)化方面提供的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1] Wardlaw C W. The biology of banana wilt（Panama disease）.lll. An examination of sucker infection though Root-bases[D]. Trinldad.B.W.I： The doetoral dissertation of Imperial College of Tropical Agriculture， 1931： 383.

[2] 中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄， 農(nóng)業(yè)部第862號(hào)公告[R]. 北京： 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局， 2007.

[3] Stover R H， Buddenhagen I W. Banana breeding： polyploidy， disease resistance and productivity[J]. Fruits， 1986， 41（3）： 175-191.

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[5] 肖榮鳳，朱育菁，李燕丹，等. 西瓜尖孢鐮刀菌FOV-135的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，24（6）：521-524.

[6] 李春強(qiáng)，梁慧施，夏亦薺，等. GFP標(biāo)記的尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疚鞴线^程觀察[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1 935-1 939.

[7] 周禮紅，李國(guó)琴，王正祥，等. 紅曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[J]. 遺傳，2005，27（3）：423-428.

[8] Lorang J M， Tuori R P， Martinez J P， et al. Green fluorescent protein is lighting up fungal biology[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（5）： 1 987-1 994.

[9] 徐 瑩，劉太國(guó)，何月秋，等. 綠色熒光蛋白及其在絲狀真菌研究中的應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)，2008，34（6）：1-6.

[10] 王淑民. 棉花枯萎病[J]. 中國(guó)棉花，1995（3）：37.endprint

1.2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調(diào)整。具體如下：于200 μL原生質(zhì)溶液中加40 μL pCT74質(zhì)粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上；28℃，倒置培養(yǎng)，7～10 d后可獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的熒光穩(wěn)定性分析及PCR檢測(cè)

挑取半固體再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下觀察檢測(cè)，以可見光下的觀察作為對(duì)照。將能夠觀察到綠色熒光的轉(zhuǎn)化子繼代培養(yǎng)5代后，進(jìn)行熒光穩(wěn)定性分析和菌落PCR檢測(cè)。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察。

2.2 轉(zhuǎn)化子熒光穩(wěn)定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化子在無篩選壓力的培養(yǎng)基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長(zhǎng)良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉(zhuǎn)化子gfp基因已被轉(zhuǎn)入到菌株中，性狀穩(wěn)定。

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)

對(duì)繼代5次的轉(zhuǎn)化子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增包含325 bp的啟動(dòng)子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區(qū)[8]，進(jìn)一步說明該gfp基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到菌株中，并具良好的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

GFP被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌研究，可作為報(bào)告基因進(jìn)行定位及定性檢測(cè)，此外在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、突變體致病力、蛋白表達(dá)、真菌與宿主相互作用、真菌環(huán)境生態(tài)學(xué)等研究中均有應(yīng)用[9]。本研究中獲得的轉(zhuǎn)化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發(fā)出極強(qiáng)的綠色熒光，說明gfp基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到菌株中，同時(shí)繼代5次后的轉(zhuǎn)化子也能經(jīng)過PCR檢測(cè)到gfp基因片段。

原生質(zhì)體的制備是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵[10]，利用孢子懸浮液培養(yǎng)12 h，得到的菌絲均為幼潤(rùn)的新鮮菌絲，且新鮮程度相對(duì)一致，易于原生質(zhì)體的制備，與肖榮鳳等[6]結(jié)果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長(zhǎng)方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉(zhuǎn)入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉(zhuǎn)化子具備較好的穩(wěn)定性。本研究所獲得的轉(zhuǎn)化菌株將被應(yīng)用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測(cè)和分析手段。

致 謝 感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所農(nóng)業(yè)微生物研究中心肖榮鳳轉(zhuǎn)贈(zèng)pCT74質(zhì)粒及其在菌株轉(zhuǎn)化方面提供的幫助。

參考文獻(xiàn)

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[5] 肖榮鳳，朱育菁，李燕丹，等. 西瓜尖孢鐮刀菌FOV-135的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，24（6）：521-524.

[6] 李春強(qiáng)，梁慧施，夏亦薺，等. GFP標(biāo)記的尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疚鞴线^程觀察[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1 935-1 939.

[7] 周禮紅，李國(guó)琴，王正祥，等. 紅曲霉原生質(zhì)體的制備、再生及其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[J]. 遺傳，2005，27（3）：423-428.

[8] Lorang J M， Tuori R P， Martinez J P， et al. Green fluorescent protein is lighting up fungal biology[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（5）： 1 987-1 994.

[9] 徐 瑩，劉太國(guó)，何月秋，等. 綠色熒光蛋白及其在絲狀真菌研究中的應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)，2008，34（6）：1-6.

[10] 王淑民. 棉花枯萎病[J]. 中國(guó)棉花，1995（3）：37.endprint

1.2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

參照肖榮鳳等[6]的方法，略做調(diào)整。具體如下：于200 μL原生質(zhì)溶液中加40 μL pCT74質(zhì)粒DNA（約2～5 μg），輕搖混勻，室溫放置20 min；滴加1.25 mL PTC溶液，邊加邊搖，室溫放置20 min；加到100 mL冷卻至40～50℃的半固體再生培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Amp 和200 μg/mL HmB），混勻，倒入底層已有半固體再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上；28℃，倒置培養(yǎng)，7～10 d后可獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的熒光穩(wěn)定性分析及PCR檢測(cè)

挑取半固體再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子的少量菌絲在熒光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下觀察檢測(cè)，以可見光下的觀察作為對(duì)照。將能夠觀察到綠色熒光的轉(zhuǎn)化子繼代培養(yǎng)5代后，進(jìn)行熒光穩(wěn)定性分析和菌落PCR檢測(cè)。先將少量菌絲用液氮碾磨，加入適量CTAB裂解液，65℃水浴10 min，離心，取上清作模板[7]。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察。

2.2 轉(zhuǎn)化子熒光穩(wěn)定性分析

將在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化子在無篩選壓力的培養(yǎng)基平板上繼代5次后，在含200 μg/mL HmB的PDA上生長(zhǎng)良好，顯微觀察到菌絲和孢子均發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2），說明這些轉(zhuǎn)化子gfp基因已被轉(zhuǎn)入到菌株中，性狀穩(wěn)定。

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)

對(duì)繼代5次的轉(zhuǎn)化子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增包含325 bp的啟動(dòng)子序列和90 bp的 ToxA基因5′端非翻譯區(qū)[8]，進(jìn)一步說明該gfp基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到菌株中，并具良好的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

GFP被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌研究，可作為報(bào)告基因進(jìn)行定位及定性檢測(cè)，此外在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、突變體致病力、蛋白表達(dá)、真菌與宿主相互作用、真菌環(huán)境生態(tài)學(xué)等研究中均有應(yīng)用[9]。本研究中獲得的轉(zhuǎn)化菌株在含200 μg/mL HmB的PDA上繼代5次后，其菌絲及孢子均能發(fā)出極強(qiáng)的綠色熒光，說明gfp基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到菌株中，同時(shí)繼代5次后的轉(zhuǎn)化子也能經(jīng)過PCR檢測(cè)到gfp基因片段。

原生質(zhì)體的制備是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵[10]，利用孢子懸浮液培養(yǎng)12 h，得到的菌絲均為幼潤(rùn)的新鮮菌絲，且新鮮程度相對(duì)一致，易于原生質(zhì)體的制備，與肖榮鳳等[6]結(jié)果一致。由于尖孢鐮刀菌為尖端生長(zhǎng)方式，菌絲尖端最幼嫩，易被酶解。本研究成功地將gfp基因轉(zhuǎn)入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中，且轉(zhuǎn)化子具備較好的穩(wěn)定性。本研究所獲得的轉(zhuǎn)化菌株將被應(yīng)用于香蕉和棉花的侵染、防治等研究中，為其提供可視化的檢測(cè)和分析手段。

致 謝 感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所農(nóng)業(yè)微生物研究中心肖榮鳳轉(zhuǎn)贈(zèng)pCT74質(zhì)粒及其在菌株轉(zhuǎn)化方面提供的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1] Wardlaw C W. The biology of banana wilt（Panama disease）.lll. An examination of sucker infection though Root-bases[D]. Trinldad.B.W.I： The doetoral dissertation of Imperial College of Tropical Agriculture， 1931： 383.

[2] 中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄， 農(nóng)業(yè)部第862號(hào)公告[R]. 北京： 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局， 2007.

[3] Stover R H， Buddenhagen I W. Banana breeding： polyploidy， disease resistance and productivity[J]. Fruits， 1986， 41（3）： 175-191.

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