許萍萍 李彬 吳翠萍 漆少廷 羅朝科 羅建國(guó) 安榆林

摘要：南京祿口國(guó)際機(jī)場(chǎng)口岸從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋(píng)果中截獲疑似褐腐病果。病果表面靠近果肩處有水漬狀褐色病斑，經(jīng)保濕培養(yǎng)后褐色病斑迅速擴(kuò)展至全果，果實(shí)表面出現(xiàn)灰褐色絨狀霉層，果實(shí)腐爛。對(duì)病果進(jìn)行分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、PCR檢測(cè)及ITS序列分析和致病性測(cè)定后，將病菌鑒定為美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）。這是江蘇省首次從旅客攜帶的澳大利亞蘋(píng)果中截獲該檢疫性有害生物。

關(guān)鍵詞：蘋(píng)果病害；真菌鑒定；旅檢；美澳型核果褐腐病菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S41-3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0119-03

收稿日期：2013-09-06

作者簡(jiǎn)介：許萍萍（1982—），女，江蘇鹽城人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫工作。E-mail：xupp@jsciq.gov.cn。褐腐病是桃、李、杏、蘋(píng)果等果樹(shù)上的一種危害嚴(yán)重的水果病害，引起該病害的病原菌之一的美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物，該病原菌的主要寄主為薔薇科果樹(shù)，尤其以核果類(lèi)李屬（Prunus）的李、杏、桃、油桃、櫻桃、蘋(píng)果、梨和葡萄等果樹(shù)受害最嚴(yán)重，曾對(duì)北美和澳大利亞的核果造成巨大損失。美澳型褐腐病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲(chǔ)藏期果實(shí)，并可在果實(shí)中潛伏侵染，隨病果遠(yuǎn)距離傳播，美澳型核果褐腐病菌目前在日本、印度、韓國(guó)、美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭、法國(guó)等多個(gè)國(guó)家均有分布，我國(guó)北京和臺(tái)灣地區(qū)也有局部發(fā)生危害的報(bào)道[1]。該病菌可隨帶病的苗木及水果通過(guò)貿(mào)易和旅客攜帶進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。2013年6月，南京祿口國(guó)際機(jī)場(chǎng)口岸從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋(píng)果中截獲一批可疑病果。為防止美澳型核果褐腐病菌傳入我國(guó)，筆者對(duì)病果及其分離物進(jìn)行了分離培養(yǎng)、病原菌形態(tài)學(xué)觀察、PCR分子檢測(cè)，并遵循柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定，對(duì)這批病蘋(píng)果攜帶的病菌進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料為南京祿口國(guó)際機(jī)場(chǎng)從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋(píng)果中截獲的可疑病果。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.2癥狀檢查及保濕培養(yǎng)

對(duì)可疑病果的癥狀進(jìn)行觀察，取有褐色病斑的果實(shí)直接進(jìn)行分離培養(yǎng)。病果初期有褐色病斑，溫度適宜時(shí)，褐色病斑迅速擴(kuò)大至全果，果肉隨之變軟腐爛。潮濕條件下，病果表面凹陷處有灰色霉層，其上產(chǎn)生分生孢子梗束。有些潛伏侵染的果實(shí)表面暫時(shí)無(wú)明顯癥狀，對(duì)這類(lèi)果實(shí)可進(jìn)行保濕培養(yǎng)，將果實(shí)放在密閉的塑料盒中，20～25 ℃下保濕培養(yǎng)，7 d 后開(kāi)始每天檢查，直至出現(xiàn)褐腐病斑癥狀，再對(duì)果實(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3組織分離與培養(yǎng)

取有褐色病斑的果實(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)，用70%乙醇對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，等乙醇揮發(fā)后，從病健交界處切取或用鑷子撕取邊長(zhǎng)為5～10 mm 的樣品，放在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)鏡檢。

1.4形態(tài)學(xué)觀察與生物學(xué)鑒定

如果菌落上的分離物形態(tài)特征與美澳型核果褐腐病菌相似，則對(duì)疑似菌株進(jìn)行純化，并對(duì)菌落的顏色、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和孢子堆的形狀等菌落形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)性狀進(jìn)行觀察和測(cè)定。先將轉(zhuǎn)到PDA 上的美澳型核果褐腐病菌疑似菌株放在22 ℃下暗培養(yǎng)4 d，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，將菌落轉(zhuǎn)移至直徑為9 cm的PDA 培養(yǎng)皿中央，22 ℃下12 h光照/12 h暗培養(yǎng)，光照波長(zhǎng)為320～380 nm、18 W黑光燈（近紫外燈）2盞，置于培養(yǎng)皿上方約15 cm處，培養(yǎng)3 d后開(kāi)始每天測(cè)量菌落直徑，直到第5天開(kāi)始計(jì)算并記錄菌落的生長(zhǎng)速度、顏色、產(chǎn)孢量、孢子堆形狀。

1.5分子生物學(xué)鑒定

1.5.1DNA提取采用Tooley等的堿裂解法[2]直接從培養(yǎng)基中快速提取菌絲DNA。疑似菌株經(jīng)純化后在PDA上生長(zhǎng) 2 d，取菌絲塊放入2 mL的離心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直徑為3 mm的鋼珠，在球磨儀（Retsch MM400，德國(guó)）上以30 f/s的頻率振蕩180 s，12 000 r/min離心5 min，取10 μL上清液直接溶于90 μL 100 mmol/L Tris溶液（pH值8.0）中。也可以采用CTAB 方法或真菌基因組提取試劑盒（如DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN，德國(guó)）提取病菌DNA。DNA提取后直接進(jìn)行PCR檢測(cè)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)[1]中推薦的方法，對(duì)分離到的疑似菌株采用PCR檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定。美澳型核果褐腐病菌的特異性引物ITS1-Mfcl 和ITS4-Mfcl 序列為5′-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3′和5′-TGGGTTTTGGCAGA-AGCACACT- 3′，預(yù)期擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為 356 bp，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司代為合成。

1.5.3PCR擴(kuò)增50 μL PCR 反應(yīng)體系中含有1×PCR緩沖液（無(wú)Mg2+）、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、各引物0.2 μmol/L、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL DNA溶液，補(bǔ)ddH2O至反應(yīng)總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，67.5 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5.4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)， 用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.5.5PCR產(chǎn)物核苷酸序列分析PCR 產(chǎn)物純化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。采用BioEdit和DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank發(fā)表的美澳型核果褐腐病菌ITS核苷酸序列進(jìn)行比較和同源性分析。

1.6致病性測(cè)定

采用菌絲塊接種法，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，作為接種菌絲塊。選用新鮮健康的蘋(píng)果果實(shí)，先用70%乙醇對(duì)要接種的果實(shí)表面進(jìn)行消毒，再用解剖刀切開(kāi)接種部位切取少量果肉，將菌絲塊接入果肉中，將接種的蘋(píng)果放入密閉塑料盒中，22 ℃下保濕培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1病果癥狀

截獲的病果初期有褐色病斑，經(jīng)保濕培養(yǎng)后4 d，褐色病斑迅速擴(kuò)大至全果，果實(shí)表面凹陷處密布灰褐色絨狀霉層（圖1），其上產(chǎn)生大量分生孢子梗束，果肉隨之變軟腐爛。

2.2病菌生物學(xué)特性

2.2.1菌落特征取病果病健交界處果皮進(jìn)行組織分離，對(duì)疑似美澳型核果褐腐病菌菌落進(jìn)行純化，取直徑4 mm菌絲塊在PDA 上22 ℃光暗交替培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)速度很快，7 d后菌落布滿直徑 9 cm 培養(yǎng)皿。菌落榛子色或灰褐色，邊緣較整齊，產(chǎn)孢量豐富，菌落表面形成明顯的同心輪紋狀分生孢子堆（圖2）。菌株的培養(yǎng)特性與van Leeuwen等描述的美澳型核

果褐腐病菌的菌落特征[3-4]一致。

2.2.2病菌形態(tài)經(jīng)顯微鏡觀察，疑似菌株菌絲無(wú)色，有分枝，分生孢子梗較短，頂端串生分生孢子，芽生，鏈狀排列，檸檬形或卵圓形，近無(wú)色，單胞（圖3）。分生孢子為 10.28～19.65 μm × 6.62 ～ 14.60 μm，平均值為14.70 μm × 9.79 μm。分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生后產(chǎn)生的芽管較長(zhǎng)。病菌的形態(tài)學(xué)特征與已報(bào)道的美澳型核果褐腐病菌的形態(tài)特征[1，3，5]完全相符。

2.3病菌PCR分子檢測(cè)及序列分析

2.3.1病菌PCR檢測(cè)采用美澳型核果褐腐病菌特異性引物ITS1-Mfc1和ITS4-Mfc1對(duì)疑似菌株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增出1條大小為356 bp的特異性目的條帶，與陽(yáng)性對(duì)照大小一致（圖4）。將PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物科技有限公司純化測(cè)序。

2.3.2病菌PCR 產(chǎn)物序列測(cè)定與同源性分析PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序和BLAST 分析，結(jié)果表明，PCR 產(chǎn)物核苷酸序列與 GenBank 中40多個(gè)美澳型核果褐腐病菌已知的ITS基因序列（GenBank登錄號(hào)：JN176556、HQ846919、GU967379、GQ979713、FJ515894、AM887528、DQ314727等）同源性均為100%。序列比對(duì)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了PCR 產(chǎn)物是美澳型核果褐腐病菌的特異性產(chǎn)物。

2.4致病性測(cè)定

采用菌絲塊對(duì)新鮮健康的蘋(píng)果果實(shí)進(jìn)行接種，經(jīng)保濕培養(yǎng)， 蘋(píng)果果實(shí)3～4 d出現(xiàn)褐色病斑，病斑擴(kuò)展迅速， 8 d后整

個(gè)果實(shí)表面全部變?yōu)楹稚?2 d后果實(shí)表面被散生的灰裼色絨狀霉層覆蓋（圖5），其上產(chǎn)生大量分生孢子堆，果實(shí)腐爛。空白對(duì)照無(wú)褐腐癥狀出現(xiàn)，也無(wú)絨狀霉層產(chǎn)生。從接種發(fā)病的蘋(píng)果果實(shí)上可重新分離到疑似美澳型核果褐腐病菌菌株，病菌的生物學(xué)特性與接種病菌完全相同。

3結(jié)論與討論

美澳型核果褐腐病菌有3個(gè)近似種，即核果鏈核盤(pán)菌（M.laxa）、果生鏈核盤(pán)菌（M. fructigena）和 M.polystroma。這4個(gè)種可通過(guò)菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管、產(chǎn)孢量和PCR特異性擴(kuò)增來(lái)加以區(qū)分[1，3-6]，通過(guò)ITS序列及微衛(wèi)星序列差異建立的常規(guī)PCR方法[1，5-7]、SYBR實(shí)

時(shí)PCR方法[8]和Taq Man-MGB探針[9]等PCR檢測(cè)方法可以快速、準(zhǔn)確地在種的水平上將這4個(gè)近似種區(qū)分開(kāi)來(lái)。

美澳型核果褐腐病菌是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物，該病原菌主要危害核果類(lèi)李屬果樹(shù)，會(huì)給果園造成巨大損失。除了蘋(píng)果以外，我國(guó)口岸多次從旅客攜帶的李、櫻桃、西梅及進(jìn)境貿(mào)易水果（葡萄、李和櫻桃）貨物中截獲過(guò)該病菌[5，10-12]。該病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲(chǔ)藏期果實(shí)，并可在果實(shí)中潛伏侵染，隨病果遠(yuǎn)距離傳播。進(jìn)境旅客攜帶的水果雖然數(shù)量少，但是水果種類(lèi)多，來(lái)源廣，產(chǎn)地復(fù)雜，美澳型核果褐腐病菌隨水果傳入的疫情風(fēng)險(xiǎn)很高，所以我國(guó)各口岸應(yīng)加強(qiáng)對(duì)入境旅客攜帶水果的檢疫，防止通過(guò)旅客攜帶的水果將該病菌傳入我國(guó)，以保護(hù)我國(guó)水果生產(chǎn)和貿(mào)易的安全。

參考文獻(xiàn)：

[1]SN/T 1871—2007 美澳型核果褐腐病菌檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[2]Tooley P W，Bunyard B A，Carras M M，et al. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes[J]. Applied Environment Microbiology，1997，63（4）：1467-1475.

[3]van Leeuwen G C M，van Kesteren H A.Delineation of the three brown rot fungi of fruit crops（Monilinia spp.）on the basis of quantitative characteristics[J]. Canadian Journal of Botany，1998，76（12）：2042-2050.

[4]van Leeuwen G M，Baayen R P，Holb I J，et al. Distinction of the asiatic brown rot fungus Monilia polystroma sp. nov.from M. fructigena[J]. Mycology Research，2002，106（4）：444-451.

[5]王衛(wèi)芳，章柱，余辛.從進(jìn)境美國(guó)櫻桃中首次截獲美澳型核果褐腐病菌[J]. 植物檢疫，2012，26（5）：88-91.

[6]Ioos R，F(xiàn)rey P.Genomic variation with Monilinia laxa，M.fructigena and M.fructicola，and application to species identification by PCR[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106 （4）：373-378.

[7]樊錦艷，朱小瓊，國(guó)立耘，等. 褐腐病菌三種分子鑒定方法的比較[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（3）：289-295.

[8]Luo Y，Ma Z，Reyes H C，et al. Quantification of airborne spores of Monilinia fructicola in stone fruit orchards of California using real-time PCR[J]. European Journal of Plant Pathology，2007，118（2）：145-154.

[9]程穎慧，王穎，章桂明，等. 應(yīng)用TaqMan MGB探針檢測(cè)美澳型核果褐腐病菌[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（7）：196-198.

[10]田利華，周?chē)?guó)梁，黃建康，等. 進(jìn)口智利李子上核果褐腐病菌鑒定[J]. 植物檢疫，2008，22（4）：201-204，封3.

[11]張慧麗，張建成，顧建鋒，等. 李褐腐病病原菌的分離和鑒定[J]. 中國(guó)果樹(shù)，2008（2）：68-69，75.

[12]王衛(wèi)芳，章柱，余辛，等. 2010年廣東口岸從進(jìn)境美國(guó)水果中截獲多種檢疫性真菌有害生物[J]. 植物檢疫，2011，25（3）：