李艷+吳強(qiáng)盛

摘要：在盆栽條件下對(duì)紅橘（Citrus tangerina）、金柑（Fortunella margarita）、枳（Poncirus trifoliata）和資陽(yáng)香橙（Citrus junos）進(jìn)行接種或不接種摩西球囊霉（Glomus mosseae），分析菌根化和非菌根化柑橘根際土壤有效磷和磷酸酶活性的變化，結(jié)果表明：接種處理顯著提高了柑橘根際土壤有效磷含量以及酸性、中性、堿性和總磷酸酶活性，且這種效應(yīng)不依賴柑橘基因型；其中，資陽(yáng)香橙對(duì)摩西球囊霉的依賴性最強(qiáng)，其菌根侵染率、根際土壤有效磷含量及其相較于不接種對(duì)照處理有效磷含量和土壤磷酸酶活性的增加幅度均最高。相關(guān)性分析表明，菌根侵染率與土壤有效磷含量、土壤磷酸酶活性之間均呈現(xiàn)顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，有效磷含量與土壤酸性磷酸酶活性間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：磷；叢枝菌根；基因型；有效磷；磷酸酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S666.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0186-03

收稿日期：2013-09-20

基金資助：湖北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2012FFA001）。

作者簡(jiǎn)介：李艷（1989—），女，湖北宜昌人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡?shù)菌根生物技術(shù)。E-mail：liyan19890201@163.com。

通信作者：吳強(qiáng)盛，博士，教授，研究方向?yàn)楣麡?shù)菌根生物技術(shù)。E-mail：wuqiangsh@163.com。磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)元素，在植物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中扮演著極其重要的角色，也能提高果樹(shù)對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性，如抗旱、抗寒、抗病等[1]。然而，土壤中90%的磷屬于難溶態(tài)，植物不能直接吸收，從而導(dǎo)致土壤磷的有效利用率極低。柑橘生長(zhǎng)在我國(guó)南方的酸性土壤，磷肥的施入容易在土壤中形成難溶的磷酸鐵和磷酸鋁化合物[2]，使得我國(guó)多數(shù)柑橘生長(zhǎng)在低磷條件下，這限制了柑橘的優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)。

目前已知在柑橘園土壤中存在一類(lèi)有益的叢枝菌根真菌，他們能夠與柑橘根系建立共生聯(lián)合體——叢枝菌根[3]。叢枝菌根真菌最重要的功能是促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤中固有磷素以及外源施入磷肥的吸收和利用，進(jìn)而改善植物的磷營(yíng)養(yǎng)，使作物達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的[4]。眾多研究表明叢枝菌根真菌可以分泌磷酸酶，顯著活化土壤中難溶性磷酸鹽，進(jìn)而提高植物有效磷含量；同時(shí)，菌根的根外菌絲可以延伸到植物根系以外的地方汲取土壤中的有效磷[5]。劉進(jìn)法等研究結(jié)果顯示，對(duì)枳進(jìn)行接種摩西球囊霉（Glomus mosseae），其基質(zhì)中有效磷含量及枳實(shí)生苗吸磷效率顯著高于未接種處理[2]。蘇友波等的試驗(yàn)表明，叢枝菌根真菌對(duì)三葉草根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均有顯著增強(qiáng)作用[6]；但是也有菌根化的植物種類(lèi)并不能分泌磷酸酶來(lái)改善土壤的有效磷水平或者宿主植物的吸磷量[7]。據(jù)此推論，宿主植物的基因型在很大程度上影響叢枝菌根共生體對(duì)土壤和植物的磷效應(yīng)。

本研究以紅橘（Citrus tangerina）、金柑（Fortunella margarita）、枳（Poncirus trifoliata）、資陽(yáng)香橙（Citrus junos）為試材，研究接種摩西球囊霉對(duì)不同基因型柑橘的根際土壤有效磷含量和磷酸酶活性的影響，以及三者之間的相關(guān)關(guān)系，從而闡明菌根對(duì)柑橘磷吸收的相關(guān)機(jī)理。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2010年10月收集不同柑橘基因型種子，包括紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙，保存于4 ℃冰箱中。2011年3月26日播種種子。供試的叢枝菌根真菌為摩西球囊霉，經(jīng)白三葉擴(kuò)繁，菌劑包含感染根段、沙、根外菌絲和孢子。試驗(yàn)用盆為塑料盆，規(guī)格是：上口內(nèi)直徑20 cm，盆底內(nèi)直徑15 cm，盆高 18 cm。盆栽基質(zhì)為長(zhǎng)江大學(xué)柑橘園的黃土，預(yù)先經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃，2 h），以消除土中原有的叢枝菌根真菌孢子。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用2×4雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素1為叢枝菌根真菌接種，包括接種叢枝菌根真菌（+AMF）和不接種叢枝菌根真菌（-AMF）2個(gè)處理，接種處理的為菌劑20 g/盆。因素2為柑橘基因型，即紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙。試驗(yàn)共8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，單盆為1個(gè)小區(qū)，每盆3株實(shí)生苗，共24盆，隨機(jī)排列。在長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院塑料溫室進(jìn)行。

1.3測(cè)定方法

2011年8月16日試驗(yàn)結(jié)束，收獲各個(gè)處理的植株及根際土100 g。將當(dāng)年生根系剪成1～2 cm長(zhǎng)的根段，置于FAA固定液中固定保存（至少24 h以上，常溫）。依照Phillips等的方法[8]對(duì)根系菌根進(jìn)行染色，然后在LEICA DME型生物顯微鏡下觀察菌根的侵染。根據(jù)吳強(qiáng)盛等提供的公式[9]進(jìn)行計(jì)算：菌根侵染率=（菌根侵染的根段長(zhǎng)度/檢查根段的總長(zhǎng)度）×100%。

土壤有效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定[10]。土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定[11]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SAS 8.1軟件的ANOVA過(guò)程對(duì)處理間作差異性測(cè)驗(yàn)，采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，CORR過(guò)程作因子間相關(guān)關(guān)系分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型柑橘的菌根侵染率

不同基因型柑橘幼苗接種的菌根侵染率各不相同，其中紅橘為29.82%、金柑為34.41%、枳為54.11%、資陽(yáng)香橙為54.25%。菌根侵染程度從小到大依次表現(xiàn)為紅橘<金柑<枳<資陽(yáng)香橙，但紅橘與金柑之間、枳與資陽(yáng)香橙之間均無(wú)顯著差異。

2.2菌根真菌對(duì)不同基因型柑橘根際土壤有效磷含量的影響

4種不同基因型柑橘的菌根化植株與非菌根化植株相比，接種顯著提高了根際土壤有效磷的含量，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙分別比非菌根化對(duì)照處理提高了37.66%、28.93%、25.58%、41.99%。接種處理之間，以資陽(yáng)香橙的有效磷含量為最高，并顯著高于其他3種不同基因型柑橘；但紅橘、金柑與枳三者之間差異不顯著。不接種處理根際土壤的有效磷含量也表現(xiàn)出相同規(guī)律。2種不同處理（+AMF和-AMF）下，4種不同基因型柑橘的土壤有效磷含量由低到高依次為紅橘<金柑<枳<資陽(yáng)香橙。endprint

2.3菌根真菌對(duì)不同基因型柑橘根際土壤磷酸酶活性的影響

各處理對(duì)根際土壤磷酸酶活性（酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶以及總磷酸酶）的影響見(jiàn)圖3，相比于不接種處理，所有的接種處理均顯著提高了根際土壤磷酸酶活性。其中對(duì)于酸性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙分別比非菌根化對(duì)照處理提高了82.72%、90.91%、49.25%、17119%（圖3-a）。對(duì)于中性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙分別比非菌根化對(duì)照處理提高了11017%、10156%、8621%、120.75%（圖3-b）。對(duì)于堿性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙分別比非菌根化對(duì)照處理提高了79.37%、7538%、97.06%、96.55%（圖3-c）。對(duì)于總磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽(yáng)香橙分別比非菌根化對(duì)照處理提高了89.66%、8986%、78.13%、136.17%（圖3-d）。

接種處理間，各種不同基因型柑橘根際土壤磷酸酶活性也不盡相同。酸性磷酸酶和中性磷酸酶的活性均以金柑為最高，以枳為最低；堿性磷酸酶活性以枳為最高，資陽(yáng)香橙為最低；但總的來(lái)說(shuō)，4種不同基因型柑橘根際土壤的總磷酸酶活性從低到高依次表現(xiàn)為資陽(yáng)香橙<枳<紅橘<金柑，非菌根化處理也表現(xiàn)出相同趨勢(shì)。

2.4不同基因型柑橘菌根侵染率與根際土壤有效磷、磷酸酶的相關(guān)關(guān)系

柑橘菌根侵染率與土壤有效磷、酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶之間均呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系。土壤有效磷僅與酸性磷酸酶之間有顯著正相關(guān)關(guān)系。土壤酸性磷酸酶與中性磷酸酶和總磷酸酶之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，與堿性磷酸酶有顯著正相關(guān)關(guān)系。

不同基因型柑橘菌根侵染率與土壤有效磷、

磷酸酶之間的相關(guān)性

指標(biāo)相關(guān)系數(shù)X1X2X3X4X5X6X11.0000.560**0.700**0.843**0.572**0.792**X21.0000.405*0.365-0.2340.216X31.0000.884**0.494*0.908**X41.0000.668**0.958**X51.0000.795**X61.000注：X1、X2、X3、X4、X5、X6分別表示菌根侵染率、土壤有效磷、土壤酸性磷酸酶、土壤中性磷酸酶、土壤堿性磷酸酶、土壤總磷酸酶；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3結(jié)論與討論

本研究表明，不同基因型柑橘對(duì)摩西球囊霉的依賴性不一樣。侵染率最高的資陽(yáng)香橙對(duì)摩西球囊霉的依賴性最強(qiáng)，其余依次為枳、金柑、紅橘。這暗示了叢枝菌根真菌對(duì)宿主植物的專一性，宿主植物的種類(lèi)會(huì)在很大程度上影響叢枝菌根的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。

同時(shí)，叢枝菌根真菌的生長(zhǎng)發(fā)育通常在一定程度上由土壤有效磷的高低所決定，表現(xiàn)為土壤有效磷與菌根的發(fā)育之間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[13]。吳強(qiáng)盛等在桃砧李上也觀察到菌根的侵染明顯受到土壤有效磷的負(fù)面影響[14]。但是，本試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)土壤有效磷與柑橘菌根侵染率之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是盆栽試驗(yàn)，土壤本身的有效磷含量極低（不接種處理的有效磷含量?jī)H為0.23～041 mg/kg）。因此，對(duì)于4種不同基因型柑橘的接種處理中，菌根侵染率越高的品種其根際土壤有效磷的含量也越高。

相關(guān)關(guān)系分析表明，菌根侵染率與土壤酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶之間均表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系，這進(jìn)一步證明了接種處理所有基因型柑橘的有效磷含量要顯著高于其相應(yīng)的對(duì)照處理。這與宋勇春等在紅三葉草上試驗(yàn)結(jié)果[15]相一致。本研究顯示，叢枝菌根真菌接種顯著增加了柑橘根際酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶和總磷酸酶活性，且不依賴柑橘基因型，說(shuō)明菌根對(duì)柑橘根際磷酸酶活性的影響不受基因型限制，也進(jìn)一步證實(shí)叢枝菌根在與宿主植物形成共生體后能夠分泌磷酸酶來(lái)促進(jìn)土壤有機(jī)磷酸酯的活化與水解，而且植物根系一般只能分泌酸性磷酸酶，因而菌根化植株高活性的堿性磷酸酶則完全是叢枝菌根真菌的功勞[16]。

綜合來(lái)看，在其他條件一致的情況下，4種不同基因型柑橘對(duì)接種摩西球囊霉在菌根侵染率、土壤有效磷含量及土壤磷酸酶活性的表現(xiàn)效應(yīng)各不相同。對(duì)于菌根侵染率和土壤有效磷含量均以資陽(yáng)香橙的菌根化效應(yīng)最強(qiáng)；對(duì)于土壤磷酸酶活性，雖然資陽(yáng)香橙的酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶活性都不是最高，但相比于不接種的對(duì)照處理，其提高幅度均為最大。這暗示了本試驗(yàn)所采用的4個(gè)柑橘品種中，資陽(yáng)香橙對(duì)摩西球囊霉的依賴性是最強(qiáng)的。由此可見(jiàn)，在柑橘生產(chǎn)中，充分考慮叢枝菌根真菌與植物磷營(yíng)養(yǎng)的互作關(guān)系是非常必要的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Smith S E，Smith F A，Jakobsen I. Mycorrhizal fungi can dominate phosphate supply to plants irrespective of growth responses[J]. Plant Physiology，2003，133（1）：16-20.

[2]劉進(jìn)法，夏仁學(xué)，王明元，等. 叢枝菌根真菌對(duì)枳利用難溶性磷酸鹽及其生長(zhǎng)的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（3）：382-386.

[3]Smith S E，Read D J. Mycorrhizal symbiosis[M]. London：Academic Press，1997.

[4]Marschner H，Dell B. Nutrient uptake in mycorrhizal symbiosis[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：89-102.

[5]Hinsinger P. Bio-availability of soil inorganic P in the rhizosphere as affected by root induced chemical changes：a review[J]. Plant and Soil，2001，237（2）：173-195.endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對(duì)根際土壤有機(jī)磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對(duì)玉米菌根際土壤磷的影響及其細(xì)胞化學(xué)定位[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強(qiáng)盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發(fā)育及其與土壤有效磷的關(guān)系[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強(qiáng)盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010.

[14]吳強(qiáng)盛，李國(guó)懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發(fā)育及其與3個(gè)土壤因子的關(guān)系[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版農(nóng)學(xué)卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對(duì)紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對(duì)根際土壤有機(jī)磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對(duì)玉米菌根際土壤磷的影響及其細(xì)胞化學(xué)定位[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強(qiáng)盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發(fā)育及其與土壤有效磷的關(guān)系[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強(qiáng)盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010.

[14]吳強(qiáng)盛，李國(guó)懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發(fā)育及其與3個(gè)土壤因子的關(guān)系[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版農(nóng)學(xué)卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對(duì)紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對(duì)根際土壤有機(jī)磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對(duì)玉米菌根際土壤磷的影響及其細(xì)胞化學(xué)定位[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強(qiáng)盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發(fā)育及其與土壤有效磷的關(guān)系[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強(qiáng)盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010.

[14]吳強(qiáng)盛，李國(guó)懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發(fā)育及其與3個(gè)土壤因子的關(guān)系[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版農(nóng)學(xué)卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對(duì)紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint