李娜+張保平+王文彬+等

摘要：采集湖南省常德地區(qū)3個雞場病料105份，并采用玻板凝集法進(jìn)行了O抗原血清型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，105份雞場病料經(jīng)分離鑒定出致病性大腸桿菌60株，30株鑒定出抗O血清型。該地區(qū)流行優(yōu)勢血清型為O55（5株）、O111（9株）、O78（15株），分別占16.67%、30%、50%。3種優(yōu)勢血清型占總定型菌株的96.67%（29/30）。

關(guān)鍵詞：雞；致病性大腸桿菌；血清型

中圖分類號： S858.315.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0171-02

收稿日期：2013-09-21

基金項(xiàng)目：湖南文理學(xué)院青年專項(xiàng)基金（編號：QNYX0811）；湖南省常德市指導(dǎo)性科技計(jì)劃（編號：2006ZD24）；湖南省“十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科（動物學(xué)）項(xiàng)目（編號：湘教發(fā)[2011]76號）；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：2008244）； 湖南省動物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號：200824632 ）。

作者簡介：李娜（1977—）女，吉林長春人，碩士，講師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：vetlina@163.com。雞大腸埃希菌病是一種危害各年齡、各品種雞的傳染性疾病，其病原為大腸桿菌（Escherichia coli），具有多種血清型。該病的主要特征包括心包炎、肝周炎、臍炎、氣囊炎、敗血癥、眼炎、滑膜炎、卵黃性腹膜炎等，多繼發(fā)新城疫、傳染性喉氣管炎等疾病，導(dǎo)致雞群高死亡率，對雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)危害極大[1]。有關(guān)雞大腸桿菌病流行病學(xué)的研究，國內(nèi)已有很多報道，主要涉及我國的主要?。ㄊ小^(qū)），而對縣（市、區(qū)）研究得不多。由于大腸桿菌血清型多，抗原復(fù)雜，小區(qū)域之間也存在較大差異，為了能準(zhǔn)確地防治雞大腸桿菌病，應(yīng)在盡可能小的區(qū)域內(nèi)對其進(jìn)行病原血清型調(diào)查，目前對常德及周邊區(qū)域雞場大腸桿菌的主要血清型分布情況的調(diào)查研究還未見報道。因此，筆者從2006年10月至2012年12月對湖南省常德地區(qū)的雞大腸桿菌病流行情況及血清型進(jìn)行調(diào)查，查清本地的主要流行菌株，為疫苗研制和選用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集2006年10月至2012年12月期間，選取湖南省常德地區(qū)飼養(yǎng)的疑似大腸桿菌病雞的臟器105份，患病雞癥狀主要表現(xiàn)敗血癥、氣囊炎、心包炎、肝周炎、滑膜炎、輸卵管炎和眼炎等。無菌采集病死雞的心包、心血、肝、脾、氣管、腹水和卵黃囊內(nèi)明顯病變的組織。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑普通瓊脂平板培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱（MAC）瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管購自浙江省杭州微生物試劑有限公司；腸道致病性大腸桿菌診斷血清（含15種血清型），購自浙江省寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；普通營養(yǎng)肉湯為自制。

1.1.3試驗(yàn)動物18～25 g小白鼠，購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)小動物室。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌形態(tài)與分離培養(yǎng)將新鮮采集的病料劃線接種于普通培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基、 EMB培養(yǎng)基上和穿刺TSI瓊脂管，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察，挑取疑似的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色反應(yīng)、排列均符合大腸桿菌的菌株劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌的數(shù)次純化，然后將純化好的細(xì)菌接種于普通斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化特性鑒定將分離的60個菌株接種普通肉湯，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h后適量接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基質(zhì)、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、MR、VP微量發(fā)酵管，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。靛基質(zhì)滴加靛基質(zhì)試劑，MR滴加MR試劑1滴即刻觀察結(jié)果；VP滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴，置于37 ℃培養(yǎng)2 h后觀察結(jié)果。

1.2.3大腸埃希菌致病性試驗(yàn)取已鑒定出生化反應(yīng)符合大腸桿菌的菌株的37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h的普通肉湯培養(yǎng)物（菌液濃度為30億CFU/mL），經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格，分別腹腔接種18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只劑量接種，每個菌株接種6只，對照組經(jīng)相同的途徑接種0.2 mL普通肉湯培養(yǎng)液，接種6只。接種后飼養(yǎng)觀察存活情況120 h，記錄小白鼠的死亡時間并對死亡的小白鼠剖檢取其肝臟、心臟后，用EMB平板進(jìn)行接種菌回收試驗(yàn)以分離致病菌。

1.2.4分離菌O血清型鑒定將以上鑒定出的致病性大腸桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，分別用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水清洗，置小圓底試管中，制成濃稠的菌懸液，然后與普通肉湯培養(yǎng)物一起于121.3 ℃下高壓處理2 h，破壞其K抗原制成高壓抗原，進(jìn)行O抗原的鑒定。將每個分離菌株的菌懸液與大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原單因子血清置于潔凈的玻板上混勻，1～2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集顆粒者為陽性反應(yīng)，初步篩選可能的O血清型，然后再用試管凝集試驗(yàn)確定O血清型。每次試驗(yàn)同時以高壓抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。具體判定按照腸道致病性大腸桿菌診斷血清（含15種血清型）使用說明書中標(biāo)準(zhǔn)檢測所有細(xì)菌分離株的大腸桿菌血清型。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)及生長情況

在普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落生長良好，濕潤，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養(yǎng)基平板上形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養(yǎng)基平板上長出圓形粉紅色、表面光滑、圓形、中等大小的菌落；TSI管底及斜面均變?yōu)辄S色、產(chǎn)氣不產(chǎn)H2S；經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

對分離出的60株細(xì)菌分別進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性。

雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

項(xiàng)目結(jié)果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結(jié)果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進(jìn)行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結(jié)論

本試驗(yàn)分離的60株細(xì)菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細(xì)菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關(guān)致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗(yàn)所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復(fù)雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關(guān)，因此在大腸桿菌的防治上應(yīng)引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護(hù)，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進(jìn)行免疫保護(hù)[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進(jìn)行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂Φ坝秒r雞大腸桿菌病的治療效果及作用機(jī)理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，上（11）：145-147.

[2]張春榮，蘇亞拉圖. 我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，13（1）：2-8.

[3]魏麟，黎曉英，劉勝貴，等. 湖南西部地區(qū)雞大腸桿菌血清型分布及耐藥性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（28）：13615-13617.

[4]宋舟，陳偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.黃其春，沈建勇. 焦米湯結(jié)合口服補(bǔ)液對初生仔豬細(xì)菌性腹瀉的治療效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：173-174.

雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

項(xiàng)目結(jié)果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結(jié)果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進(jìn)行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結(jié)論

本試驗(yàn)分離的60株細(xì)菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細(xì)菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關(guān)致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗(yàn)所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復(fù)雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關(guān)，因此在大腸桿菌的防治上應(yīng)引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護(hù)，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進(jìn)行免疫保護(hù)[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進(jìn)行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護(hù)作用。

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雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

項(xiàng)目結(jié)果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結(jié)果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進(jìn)行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結(jié)論

本試驗(yàn)分離的60株細(xì)菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細(xì)菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關(guān)致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗(yàn)所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復(fù)雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關(guān)，因此在大腸桿菌的防治上應(yīng)引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護(hù)，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進(jìn)行免疫保護(hù)[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進(jìn)行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

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