邢玉娟+陳茜+陳玉庫+等

摘要：將氧化苦參堿（OM）-黃芪多糖（APS）、OM-APS-梔子苷（GP）、甘草酸（GA）-APS和GA-APS-GP 等4個(gè)中藥復(fù)方分別用MEM培養(yǎng)液溶解倍比稀釋成1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μg/mL 等10個(gè)濃度，再分別加入到培養(yǎng)24 h且已經(jīng)長成單層雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的培養(yǎng)體系中，通過MTT法測定4個(gè)中藥復(fù)方對雞胚成纖維細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS-GP對CEF的安全濃度均為1 000 μg/mL，GA-APS為500 μg/mL；OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS在500～1.96 μg/mL，GA-APS-GP在500～3.92 μg/mL濃度范圍內(nèi)對CEF生長均有明顯的促進(jìn)作用，作用最強(qiáng)的是OM-APS-GP，其次是OM-APS、GA-APS和GA-APS-GP。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方；雞胚成纖維細(xì)胞；生長；安全濃度

中圖分類號：S853.74文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）06-0149-03

收稿日期：2013-09-06

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃（編號：2008BADB4B06）；江蘇青藍(lán)工程骨干教師資助項(xiàng)目。

作者簡介：邢玉娟（1964—），女，山東濟(jì)南人，副教授，主要從事中藥藥理研究。E-mail：1903048595@qq.com。

通信作者：胡元亮，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn。有研究證明，中藥為一種免疫增強(qiáng)劑，具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優(yōu)勢，不僅能克服油乳類和鋁膠類化學(xué)佐劑副作用大、局部刺激性強(qiáng)、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2]，而且能顯著增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌[3-4]。

有試驗(yàn)證明，氧化苦參堿（oxymatrine，OM）和黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）在先于病毒加入細(xì)胞、后于病毒加入細(xì)胞和與病毒同時(shí)加入細(xì)胞等3種方式加入后均能抑制病毒生長，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在先于病毒加入和與病毒同時(shí)加入時(shí)有抑制病毒生長作用，梔子苷（geniposide，GP）只有在先于病毒加入時(shí)才能顯現(xiàn)出一定的抑制病毒感染細(xì)胞能力的作用[5-6]。本試驗(yàn)選用體外試驗(yàn)對雞新城疫病毒（NDV）呈現(xiàn)抑制作用的OM、APS、GP和GA，按一定比例分別組成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4個(gè)中藥復(fù)方，通過MTT（四唑溴鹽）法[7-11]測定4個(gè)中藥復(fù)方對雞胚成纖維細(xì)胞（chickembryo fibroblast，CEF）增殖的影響，為下一步體內(nèi)試驗(yàn)作準(zhǔn)備。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物

根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果[5]，將OM、GA、GP、APS 等4種中藥按一定比例組成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4個(gè)復(fù)方，分別用MEM培養(yǎng)液溶解稀釋成1 000 μg/mL，高壓滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前吸取各藥0.5 mL至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1孔中，加入細(xì)胞維持液 0.5 mL，倍比稀釋至10孔。

1.2主要試劑

MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說明書配制，再加入犢牛血清（5%為細(xì)胞生長液、2%為細(xì)胞維持液），再按常規(guī)量加入0.03%谷胺酰氨和雙抗（各100 IU/mL）；胰蛋白酶，進(jìn)口分裝，用PBS（pH值7.4）配制成0.25%的溶液，0.22 μm 混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?；MTT溶液，Sigma公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的PBS液配制，使終濃度為2 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，4 ℃冰箱保存，1 周內(nèi)用完；裂解液二甲亞砜（DMSO），分析純，江蘇蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院生產(chǎn)。

1.3主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，美國Revco公司生產(chǎn)；XSZ-DZ型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀，國營華東電子管廠制造；75-2A型微量振蕩器，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板和24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國 Nunclon 公司生產(chǎn)。

1.4試驗(yàn)方法

按文獻(xiàn)[12-13]的方法制備CEF。用細(xì)胞生長液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至100萬個(gè)/mL，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待CEF剛形成單層時(shí)加藥。試驗(yàn)組分別加入不同濃度的中藥復(fù)方 100 μL/孔，每個(gè)濃度重復(fù)4 孔，每2種中藥成分復(fù)方共用一塊細(xì)胞板并重復(fù)2塊細(xì)胞板；對照組4 孔，僅加細(xì)胞維持液；另設(shè)無細(xì)胞孔為測定時(shí)的空白調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)。加藥后 48 h 測定細(xì)胞增殖情況。

1.5細(xì)胞增殖測定

用MTT法測定細(xì)胞增殖的情況：測定前4 h加入 50 μL/孔 MTT溶液；測定時(shí)快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，甩去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100 μL/孔裂解液，室溫下振蕩5 min使結(jié)晶物溶解；然后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定D570 nm，作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)。D570 nm與活細(xì)胞的增殖呈正比，即D570 nm越大，細(xì)胞增殖越旺盛。

1.6中藥對CEF安全濃度的判定

根據(jù)D570 nm測定結(jié)果判定中藥對CEF的安全濃度，選擇D570 nm與對照差異不顯著的試驗(yàn)組的最高中藥濃度作為安全濃度的上限[14]。

1.7數(shù)據(jù)處理

計(jì)算4 孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，并比較各中藥組分對CEF增殖率的差異性。增殖率=（各組加藥后的D570 nm-對照的D570 nm）/對照的D570 nm×100%。

2結(jié)果與分析

2.14個(gè)中藥復(fù)方對CEF增殖的影響

3.91～31.25 μg/mL OM-APS 的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），1.95、62.50～500.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm高于對照但不顯著（P>0.05），1 000.00 μg/mL OM-APS的D570 mm低于對照但不顯著（P>0.05）。說明OM-APS濃度在3.91～3125 μg/mL時(shí)對細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用。綜合以上結(jié)果可知，OM-APS的最大安全濃度為1 000.00 μg/mL（表1）。表14個(gè)中藥復(fù)方對CEF增殖的影響

濃度

（μg/mL）D570 nmOM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.000.305±0.005d0.313±0.015c0.332±0.009e0.325±0.020d500.000.345±0.051bc0.367±0.015b0.365±0.019cd0.372±0.017bc250.000.370±0.014abc0.388±0.013ab0.365±0.012cd0.375±0.023bc125.000.370±0.008abc0.387±0.006ab0.366±0.015cd0.388±0.017ab62.500.373±0.015abc0.383±0.015ab0.380±0.010abcd0.412±0.009a31.250.380±0.01ab0.380±0.010ab0.376±0.015bcd0.392±0.005ab15.620.380±0.010ab0.400±0.010a0.386±0.015abc0.382±0.026abc7.810.382±0.020ab0.370±0.010b0.403±0.005a0.360±0.008bc3.910.393±0.017a0.380±0.010ab0.400±0.008ab0.372±0.017bc1.950.372±0.012abc0.366±0.005b0.375±0.012bcd0.347±0.053cd對照0.336±0.028cd0.336±0.028c0.356±0.022d0.356±0.022bcd注：同列數(shù)據(jù)后不同字母者表示差異顯著（P<0.05）。

1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm均顯著高于對照，1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm低于對照但不顯著（P>0.05）。說明OM-APS-GP在1.95～500.00 μg/mL 時(shí)對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，OM-APS-GP的最大安全濃度為1 000 μg/mL（表1）。

3.91～15.62 μg/mL GA-APS的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的 D570 nm顯著低于對照，1.95、31.25～500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于對照但不顯著（P>0.05）。說明GA-APS在3.91～15.62 μg/mL能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，但隨濃度升高，促進(jìn)增殖作用逐漸減弱，1 000.00 μg/mL 對細(xì)胞增殖有抑制作用。綜合以上結(jié)果可知，GA-APS最大安全濃度為500.00 μg/mL（表1）。

62.50 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），125.00～500.00、3.91～31.25 μg/mL 的 D570 nm高于對照但不顯著（P>0.05），1.95、1 000.00 μg/mL 的 D570 nm 低于對照但不顯著。說明62.50 μg/mL GA-APS-GP對細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用，且隨濃度的升高或降低，促進(jìn)增殖作用逐漸減弱。綜合以上結(jié)果可知，GA-APS-GP最大安全濃度為1 000.00 μg/mL（表1）。

2.24個(gè)復(fù)方對CEF增殖率的影響

對CEF增殖率最高的是OM-APS-GP，當(dāng)其濃度為 15.62 μg/mL 時(shí)增殖率達(dá)到19.05%。OM-APS有8個(gè)濃度、OM-APS-GP有7個(gè)濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2個(gè)濃度使CEF增殖率達(dá)到了10%以上（表2）。

OM-APS促進(jìn)CEF生長的作用曲線呈馬鞍形，有2個(gè)峰值，分別是3.91、250.00 μg/mL；OM-APS-GP的促生長曲線呈駝峰形，有3個(gè)峰值，分別是3.91、15.62、250.00 μg/mL；GA-APS的促生長曲線呈駝峰形，有3個(gè)峰值，分別是7.81、62.50、500.00 μg/mL；GA-APS-GP 的促生長曲線呈單峰狀，在62.50 μg/mL達(dá)到峰值。

表24個(gè)中藥復(fù)方對CEF增殖率的影響

濃度

（μg/mL）增殖率（%）OM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.00-9.23-6.85-6.74-8.71500.002.689.232.534.49250.0010.1215.482.535.34125.0010.1215.182.818.9962.5011.0113.996.7415.7331.2513.1013.105.6210.1115.6213.1019.058.437.307.8113.6910.1213.201.123.9116.9613.1012.364.491.9510.718.935.34-2.53對照0000

3結(jié)論與討論

3.1中藥復(fù)方對CEF的安全濃度

根據(jù)D570 nm測定結(jié)果可知，1 000.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm低于對照但不顯著（P>0.05）；500.00～1.95 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm均顯著高于對照（P<005），1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm低于對照但不顯著（P>0.05）；500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于對照但不顯著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的D570 nm顯著低于對照（P<0.05）；500.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm高于對照但不顯著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm低于對照但不顯著。綜合以上結(jié)果可知，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS、GA-APS-GP 對CEF的安全濃度分別為1 000.00、1 000.00、500.00、1 000.00 μg/mL。

3.2中藥復(fù)方對CEF增殖的影響

D570 nm能直接反映被測樣品中活細(xì)胞的增殖情況，兩者呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），說明這4個(gè)中藥復(fù)方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)CEF增殖。其中，OM-APS-GP促進(jìn)CEF增殖的濃度范圍最大，所選濃度范圍對細(xì)胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結(jié)果可知，這4 個(gè)中藥復(fù)方促進(jìn)CEF增殖作用的強(qiáng)弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中藥復(fù)方促進(jìn)CEF生長的量效關(guān)系

從試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，4個(gè)中藥復(fù)方在高濃度（1 000.00 μg/mL）時(shí)對細(xì)胞生長均起抑制作用，隨著濃度的降低，表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用，但這種促進(jìn)增殖的作用在達(dá)到峰值后又逐漸減弱，說明中藥復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞增殖要有合適的濃度[15]。

本試驗(yàn)中OM-APS有8 個(gè)濃度、OM-APS-GP有7 個(gè)濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個(gè)濃度對CEF增殖率達(dá)到了10%以上，在前面的試驗(yàn)中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 個(gè)濃度達(dá)到10%以上，說明復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞生長作用優(yōu)于單體，發(fā)揮了協(xié)同作用，這和王德云等的研究結(jié)果[16-17]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓慶功，崔艷紅，趙玉軍.免疫增強(qiáng)劑在雞疫病防治中的應(yīng)用[J]. 獸藥與飼料添加劑，2006，11（2）：19-22.

[2]龔曉明，吳耀妹. 免疫佐劑研究的現(xiàn)狀與趨勢[J]. 中國獸藥雜志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振環(huán)，胡元亮，馬霞，等. 硫酸化香菇多糖對新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陳玉庫，邢玉娟，蔡丙嚴(yán)，等. 氧化苦參堿等七種中藥成分對單層雞胚成纖維細(xì)胞增殖的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，等. 7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能力的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2011，9（9）：46-49.

[7]劉釗，楊占秋，肖紅，等. MTT法在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]許斌，周雙宬，黃玉仙，等. 氧化苦參堿在鴨原代肝細(xì)胞中抗鴨乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2006，22（5）：369-374.

[9]程寶鶯. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M]. 廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，劉家國，等. 黃芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿總黃酮對新城疫病毒感染細(xì)胞的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中藥成分與新城疫病毒感作后對病毒感染活性的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，萊因萬德L A.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南：上冊[M]. 黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2001.

[13]辛華. 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[14]殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10種中藥成分對CEF的增殖和抵抗NDV感染的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孫峻嶺，等. 復(fù)方中藥成分對新城疫疫苗免疫雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和血清抗體效價(jià)的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：194-196.

[17]孫峻嶺，薛家賓，胡元亮，等. 中藥成分復(fù)方的佐劑作用及其與中藥復(fù)方的功效比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：109-112.金穗華，王振云，李慧. 家畜精子形態(tài)的判別與描述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：152-156.

3.2中藥復(fù)方對CEF增殖的影響

D570 nm能直接反映被測樣品中活細(xì)胞的增殖情況，兩者呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），說明這4個(gè)中藥復(fù)方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)CEF增殖。其中，OM-APS-GP促進(jìn)CEF增殖的濃度范圍最大，所選濃度范圍對細(xì)胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結(jié)果可知，這4 個(gè)中藥復(fù)方促進(jìn)CEF增殖作用的強(qiáng)弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中藥復(fù)方促進(jìn)CEF生長的量效關(guān)系

從試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，4個(gè)中藥復(fù)方在高濃度（1 000.00 μg/mL）時(shí)對細(xì)胞生長均起抑制作用，隨著濃度的降低，表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用，但這種促進(jìn)增殖的作用在達(dá)到峰值后又逐漸減弱，說明中藥復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞增殖要有合適的濃度[15]。

本試驗(yàn)中OM-APS有8 個(gè)濃度、OM-APS-GP有7 個(gè)濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個(gè)濃度對CEF增殖率達(dá)到了10%以上，在前面的試驗(yàn)中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 個(gè)濃度達(dá)到10%以上，說明復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞生長作用優(yōu)于單體，發(fā)揮了協(xié)同作用，這和王德云等的研究結(jié)果[16-17]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓慶功，崔艷紅，趙玉軍.免疫增強(qiáng)劑在雞疫病防治中的應(yīng)用[J]. 獸藥與飼料添加劑，2006，11（2）：19-22.

[2]龔曉明，吳耀妹. 免疫佐劑研究的現(xiàn)狀與趨勢[J]. 中國獸藥雜志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振環(huán)，胡元亮，馬霞，等. 硫酸化香菇多糖對新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陳玉庫，邢玉娟，蔡丙嚴(yán)，等. 氧化苦參堿等七種中藥成分對單層雞胚成纖維細(xì)胞增殖的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，等. 7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能力的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2011，9（9）：46-49.

[7]劉釗，楊占秋，肖紅，等. MTT法在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]許斌，周雙宬，黃玉仙，等. 氧化苦參堿在鴨原代肝細(xì)胞中抗鴨乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2006，22（5）：369-374.

[9]程寶鶯. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M]. 廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，劉家國，等. 黃芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿總黃酮對新城疫病毒感染細(xì)胞的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中藥成分與新城疫病毒感作后對病毒感染活性的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，萊因萬德L A.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南：上冊[M]. 黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2001.

[13]辛華. 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[14]殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10種中藥成分對CEF的增殖和抵抗NDV感染的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孫峻嶺，等. 復(fù)方中藥成分對新城疫疫苗免疫雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和血清抗體效價(jià)的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：194-196.

[17]孫峻嶺，薛家賓，胡元亮，等. 中藥成分復(fù)方的佐劑作用及其與中藥復(fù)方的功效比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：109-112.金穗華，王振云，李慧. 家畜精子形態(tài)的判別與描述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：152-156.

3.2中藥復(fù)方對CEF增殖的影響

D570 nm能直接反映被測樣品中活細(xì)胞的增殖情況，兩者呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm顯著高于對照（P<0.05），說明這4個(gè)中藥復(fù)方在一定的濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)CEF增殖。其中，OM-APS-GP促進(jìn)CEF增殖的濃度范圍最大，所選濃度范圍對細(xì)胞生長均無抑制作用。綜合增殖率和D570 nm 結(jié)果可知，這4 個(gè)中藥復(fù)方促進(jìn)CEF增殖作用的強(qiáng)弱依次為OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中藥復(fù)方促進(jìn)CEF生長的量效關(guān)系

從試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，4個(gè)中藥復(fù)方在高濃度（1 000.00 μg/mL）時(shí)對細(xì)胞生長均起抑制作用，隨著濃度的降低，表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用，但這種促進(jìn)增殖的作用在達(dá)到峰值后又逐漸減弱，說明中藥復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞增殖要有合適的濃度[15]。

本試驗(yàn)中OM-APS有8 個(gè)濃度、OM-APS-GP有7 個(gè)濃度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 個(gè)濃度對CEF增殖率達(dá)到了10%以上，在前面的試驗(yàn)中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 個(gè)濃度達(dá)到10%以上，說明復(fù)方促進(jìn)細(xì)胞生長作用優(yōu)于單體，發(fā)揮了協(xié)同作用，這和王德云等的研究結(jié)果[16-17]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓慶功，崔艷紅，趙玉軍.免疫增強(qiáng)劑在雞疫病防治中的應(yīng)用[J]. 獸藥與飼料添加劑，2006，11（2）：19-22.

[2]龔曉明，吳耀妹. 免疫佐劑研究的現(xiàn)狀與趨勢[J]. 中國獸藥雜志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振環(huán)，胡元亮，馬霞，等. 硫酸化香菇多糖對新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陳玉庫，邢玉娟，蔡丙嚴(yán)，等. 氧化苦參堿等七種中藥成分對單層雞胚成纖維細(xì)胞增殖的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，等. 7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能力的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2011，9（9）：46-49.

[7]劉釗，楊占秋，肖紅，等. MTT法在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]許斌，周雙宬，黃玉仙，等. 氧化苦參堿在鴨原代肝細(xì)胞中抗鴨乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2006，22（5）：369-374.

[9]程寶鶯. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M]. 廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，劉家國，等. 黃芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿總黃酮對新城疫病毒感染細(xì)胞的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中藥成分與新城疫病毒感作后對病毒感染活性的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，萊因萬德L A.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南：上冊[M]. 黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2001.

[13]辛華. 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[14]殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10種中藥成分對CEF的增殖和抵抗NDV感染的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孫峻嶺，等. 復(fù)方中藥成分對新城疫疫苗免疫雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和血清抗體效價(jià)的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：194-196.

[17]孫峻嶺，薛家賓，胡元亮，等. 中藥成分復(fù)方的佐劑作用及其與中藥復(fù)方的功效比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：109-112.金穗華，王振云，李慧. 家畜精子形態(tài)的判別與描述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：152-156.