楊陽+金東淳+于小梅+唐麗娜

摘要：用PCR-DGGE方法，分析長白山區(qū)人參根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。以三年生、五年生的人參根際土壤及無參地土壤為材料，對PCR反應條件、DGGE中凝膠單體、變性劑濃度進行了優(yōu)化，并對真菌3套引物進行了對比分析，得出細菌16S rDNA V3區(qū)引物314F-GC/518R、8%凝膠單體、60%～40%變性劑DGGE分離效果較好；真菌ITS區(qū)引物，12%凝膠單體、60%變性劑，6%凝膠單體、40%變性劑搭配效果最佳。用該反應體系擴增出來的PCR產(chǎn)物，在DGGE凝膠上能夠清晰地分辨出人參根際土壤細菌和真菌的多樣性，由此分析出細菌、真菌的群落結(jié)構(gòu)都存在明顯差異。此方法簡便快捷，為進一步研究人參根際土壤微生物奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人參（Panax ginseng C. A. Meyer）；根際土壤微生物；PCR-DGGE；體系優(yōu)化；多樣性

中圖分類號： Q938文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0052-03

收稿日期：2014-01-16

基金項目：韓國農(nóng)村振興廳國際合作項目（編號：41309001）。

作者簡介：楊陽（1989—），女，吉林遼源人，碩士研究生，從事微生物分子生物學研究。E-mail：yangyangopq@sina.com。

通信作者：金東淳，副教授。Tel：（0433）2435559；E-mail：jdc1200@ybu.edu.cn。微生物與植物的生長存在著密切的聯(lián)系，其群落的變化直接影響植物病害發(fā)生與否，所以對微生物進行深入研究尤為必要[1]。由于自然界中絕大多數(shù)微生物不可以進行純培養(yǎng)，傳統(tǒng)純培養(yǎng)法就存在著局限性，造成大量微生物信息丟失[2]。而基于變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中解鏈溫度不同的原理，通過梯度變性膠將不同微生物的DNA分開，具有直觀、快速和不依賴于細菌培養(yǎng)的優(yōu)點，已廣泛應用于微生物群落的多樣性分析[3-7]。人參（Panax ginseng C. A. Meyer）為五加科人參屬多年生宿根雙子葉植物，被人們稱為“百草之王”，是聞名遐邇的“東北三寶”之一，是馳名中外、老幼皆知的名貴藥材[8]。由于人參屬于忌連作作物，存在著連作障礙，栽過一茬人參的土壤繼續(xù)種植人參后，人參產(chǎn)量急劇下降，一般要等到20～30年后才能繼續(xù)種植人參。采用伐林栽參，違背了可持續(xù)發(fā)展的原則，因此，為克服連作障礙，對人參根際土壤微生物的研究備受關(guān)注。本研究采用PCR-DGGE方法，旨在建立人參根際土壤微生物16S、18S rDNA文庫，探究人參根際土壤微生物的多樣性，構(gòu)建根際微生物種類信息，從微生物角度闡明人參連作障礙機理。

1材料與方法

1.1材料

土壤樣品（1號、2號為三年生有參地，3號為三年生無參地，4號、5號為五年生有參地，6號為五年生無參地）于2013年9月1日在吉林省延邊朝鮮族自治州安圖縣新合鄉(xiāng)青溝子村人參種植基地采集，共6個樣品，放入無菌袋中置-80 ℃冰箱中保存。

1.2主要儀器

WD-9402A基因擴增儀（北京市六一儀器廠）；DGGE-1B型變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)（南京新校園生物技術(shù)研究所）；凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.3主要試劑

土壤微生物DNA提取試劑盒（the Power Soil DNA extraction kit，美國加利福尼亞州Mobio公司）；引物（生工生物工程上海有限公司）；TaKaRa Taq（Code No.R001B，寶生物工程大連有限公司）。

1.4方法

1.4.1土壤微生物總DNA提取取土樣去除雜質(zhì)，充分研磨后稱取0.25 g，用the Power Soil DNA extraction kit試劑盒，按照說明書的步驟進行DNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，與DNA Maker作對照，將各樣品DNA濃度調(diào)到 20 ng/μL 左右，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2PCR反應體系優(yōu)化在25 μL PCR反應體系中，固定2.5 μL 10×Buffer和0.4 μL Taq（5 U/μL）的加入量，按照單因素試驗方法檢測其他因素對PCR的影響。各變量設(shè)計5個梯度（表1）。引物314F-GC/518R，擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃最后延伸6 min[9]。

表1PCR反應體系優(yōu)化設(shè)計

編號DNA

（ng）dNTPs

（mmol/L）Mg2+

（mmol/L）引物

（μmol）17.50.050.51.2222.50.201.52.4337.50.352.53.6452.50.503.54.8567.50.654.56.0

1.4.3PCR-DGGE反應體系優(yōu)化擴增細菌16S V3區(qū)的引物和程序與“1.4.2”節(jié)相同，經(jīng)一次PCR 50 μL反應體系。DGGE用8%（m/V）的凝膠單體，變性劑范圍40%～60%，反應條件為：溫度60 ℃，A階段電壓60 V，1 h；B階段電壓 100 V，15 h。擴增真菌分別用特異性引物FF390/FR1-GC；ITS1/ITS4、ITS1-GC/ITS2；NS1/EF3、NS1/FR1-GC。（1）引物FF390/FR1-GC，經(jīng)一次PCR 50 μL反應體系，擴增程序：95 ℃預變性8 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火45s，72 ℃延伸 2 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。（2）引物ITS1/ITS4、ITS1-GC/ITS2用嵌套式PCR（巢式PCR），第一次PCR 25 μL反應體系，擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸10 min；第二次PCR 50 μL反應體系，擴增程序不變。（3）引物NS1/EF3、NS1/FR1-GC用嵌套式PCR，第一次PCR 25 μL反應體系，擴增程序：94 ℃預變性8 min；94 ℃ 變性30 s，47 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min；第二次PCR 50 μL反應體系，變化退火溫度48 ℃ 45 s。首先，真菌3套引物DGGE均用b條件：12%凝膠單體、60%變性劑，6%凝膠單體、40%變性劑，反應條件為：溫度60 ℃，A階段電壓60 V、1 h，B階段電壓 120 V、26 h。電泳完畢，將膠板于含有EB的緩沖液中染色30 min，將染色后的凝膠置凝膠成像儀中拍攝并分析。另外，真菌ITS區(qū)引物DGGE用a條件：8%（m/V）的凝膠單體，變性劑范圍40%～60%，反應條件為：溫度60 ℃，A階段電壓60 V、1 h，B階段電壓120 V、26 h。

2結(jié)果與分析

2.1土壤微生物總DNA提取效果檢測

土壤微生物總DNA的提取效果直接影響后續(xù)試驗，本試驗用the Power Soil DNA extraction kit試劑盒，瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖1，條帶清晰。

2.2PCR反應體系優(yōu)化

影響PCR擴增效果的因素有多種，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的濃度在PCR反應體系中的影響尤為重大。為

此，本試驗中采用單因素試驗對其適宜的濃度進行了優(yōu)化。（1）DNA濃度太低會降低分子碰撞的概率，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定；濃度太高會增加非專一擴增產(chǎn)物或出現(xiàn)彌散性條帶[10]。（2）dNTPs是PCR反應的原料，濃度太低會過早消耗，無法繼續(xù)合成DNA，濃度太高會導致非特異性擴增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，適量的濃度會提高PCR的擴增效率，濃度過低會降低Taq酶的活性，擴增產(chǎn)物少甚至擴不出來，濃度太高會形成金屬螯合物，不利于PCR的進行[12]。（4）引物濃度太低擴增產(chǎn)物太少，太高會導致非特異性擴增或引物之間形成二聚體[13-14]。

2.3PCR-DGGE反應體系優(yōu)化

要獲得區(qū)分不同樣品的最大分辨率的DGGE圖譜，合理的凝膠梯度、變性劑梯度及電泳時間十分重要。利用合理的

3討論與結(jié)論

PCR-DGGE反應涉及諸多因素，每個因素的反應參數(shù)對整個體系的穩(wěn)定性和重復性都有影響，確定合適的反應參數(shù)是確保土壤微生物分析準確的前提。本試驗采用單因素變化設(shè)計，對各主要影響因素（模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度）進行優(yōu)化，得到人參根際土壤微生物PCR-DGGE反應體系優(yōu)化結(jié)果：25反應體系中DNA濃度52.5 ng、dNTPs濃度0.20 mmol/L、Mg2+濃度1.50 mmol/L、引物濃度4.8 μmol搭配效果最佳。

本試驗中細菌DGGE圖譜可以看出每個樣品均可分離出較多的條帶，其中不同的條帶代表不同細菌的基因片段，說明每個樣品都存在著豐富的細菌種類，并且每個樣品的分離條帶差異不明顯。真菌DGGE圖譜可以看出根際真菌與非根際真菌種類存在明顯差異，并且真菌種類隨著種植年限的增加而變少。人參的種植年限越高，其根際優(yōu)勢種群越少，病害越易發(fā)生，所以，真菌群落的動態(tài)變化與病害的發(fā)生存在著直接的關(guān)系。

DGGE指紋圖譜能夠直觀地反映根際微生物的變化，它是一種能夠提供微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究方法，為了進一步分析其多樣性，還需要對DGGE條帶進行切膠回收、克隆測序，后續(xù)試驗正在進行當中。另外，利用基因組學、蛋白質(zhì)組學等方法，對木霉菌、病原菌、人參三方的互作關(guān)系進行進一步研究，了解群落中占優(yōu)勢種群、病原菌種群的變化趨勢，研制木霉菌新的生物制劑，會對人參病害的發(fā)生起到一定的預防作用，以期為克服人參連作障礙取得突破性進展。

參考文獻：

[1]王萌，嚴鑄云，何冬梅，等. 川芎內(nèi)生真菌PCR-DGGE分析條件的建立和優(yōu)化[J]. 華西藥學雜志，2013，28（4）：335-337.

[2]Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

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[4]Ning J，Liebich J，Kstner M，et al. Different influences of DNA purity indices and quantity on PCR-based DGGE and functional gene microarray in soil microbial community study[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，82（5）：983-993.

[5]Hovda M B，Lunestad B T，F(xiàn)ontanillas R，et al. Molecular characterisation of the intestinal microbiota of farmed Atlantic salmon（Salmo salar L.）[J]. Aquaculture，2007，272（1/2/3/4）：581-588.

[6]劉慧杰，楊彩云，田蘊，等. 基于PCR-DGGE技術(shù)的紅樹林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 微生物學報，2010，50（7）：923-930.

[7]高崇洋，趙陽國，王愛杰，等. 耕作和施肥對不同深度黑土中細菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 微生物學報，2010，50（1）：67-75.

[8]張國榮，龐立杰，董宇. 關(guān)于人參栽培可持續(xù)發(fā)展的思考[J]. 人參研究，2007，19（4）：42-43.

[9]Huang X，Tian Y，Luo Y R，et al. Modified sublimation to isolate phenanthrene-degrading bacteria of the genera Sphingomonas and Burkholderia from Xiamen oil port[J]. Marine Pollution Bulletin，2008，57（6/12）：538-543.

[10]楊華，宋緒忠，尹光天，等. 黃藤ISSR反應體系的條件優(yōu)化[J]. 福建林學院學報，2006，26（2）：152-155.

[11]Joshi S P，Gupta V S，Aggarwal R K，et al. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat（ISSR） polymorphism in the genus Oryza[J]. Theoretical and Applied Genetics，2000，100（8）：1311-1320.

[12]林萬明，林萬明. PCR技術(shù)操作和應用指南[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，1993：7-14.

[13]李海生，陳桂珠. 紅樹植物海桑簡單重復序列區(qū)間（ISSR）條件的優(yōu)化[J]. 廣東教育學院學報，2004，24（2）：80-83.

[14]Watanabe K，Kodama Y，Harayama S. Design and evaluation of PCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting[J]. Journal of Microbiological Methods，2001，44（3）：

2結(jié)果與分析

2.1土壤微生物總DNA提取效果檢測

土壤微生物總DNA的提取效果直接影響后續(xù)試驗，本試驗用the Power Soil DNA extraction kit試劑盒，瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖1，條帶清晰。

2.2PCR反應體系優(yōu)化

影響PCR擴增效果的因素有多種，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的濃度在PCR反應體系中的影響尤為重大。為

此，本試驗中采用單因素試驗對其適宜的濃度進行了優(yōu)化。（1）DNA濃度太低會降低分子碰撞的概率，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定；濃度太高會增加非專一擴增產(chǎn)物或出現(xiàn)彌散性條帶[10]。（2）dNTPs是PCR反應的原料，濃度太低會過早消耗，無法繼續(xù)合成DNA，濃度太高會導致非特異性擴增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，適量的濃度會提高PCR的擴增效率，濃度過低會降低Taq酶的活性，擴增產(chǎn)物少甚至擴不出來，濃度太高會形成金屬螯合物，不利于PCR的進行[12]。（4）引物濃度太低擴增產(chǎn)物太少，太高會導致非特異性擴增或引物之間形成二聚體[13-14]。

2.3PCR-DGGE反應體系優(yōu)化

要獲得區(qū)分不同樣品的最大分辨率的DGGE圖譜，合理的凝膠梯度、變性劑梯度及電泳時間十分重要。利用合理的

3討論與結(jié)論

PCR-DGGE反應涉及諸多因素，每個因素的反應參數(shù)對整個體系的穩(wěn)定性和重復性都有影響，確定合適的反應參數(shù)是確保土壤微生物分析準確的前提。本試驗采用單因素變化設(shè)計，對各主要影響因素（模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度）進行優(yōu)化，得到人參根際土壤微生物PCR-DGGE反應體系優(yōu)化結(jié)果：25反應體系中DNA濃度52.5 ng、dNTPs濃度0.20 mmol/L、Mg2+濃度1.50 mmol/L、引物濃度4.8 μmol搭配效果最佳。

本試驗中細菌DGGE圖譜可以看出每個樣品均可分離出較多的條帶，其中不同的條帶代表不同細菌的基因片段，說明每個樣品都存在著豐富的細菌種類，并且每個樣品的分離條帶差異不明顯。真菌DGGE圖譜可以看出根際真菌與非根際真菌種類存在明顯差異，并且真菌種類隨著種植年限的增加而變少。人參的種植年限越高，其根際優(yōu)勢種群越少，病害越易發(fā)生，所以，真菌群落的動態(tài)變化與病害的發(fā)生存在著直接的關(guān)系。

DGGE指紋圖譜能夠直觀地反映根際微生物的變化，它是一種能夠提供微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究方法，為了進一步分析其多樣性，還需要對DGGE條帶進行切膠回收、克隆測序，后續(xù)試驗正在進行當中。另外，利用基因組學、蛋白質(zhì)組學等方法，對木霉菌、病原菌、人參三方的互作關(guān)系進行進一步研究，了解群落中占優(yōu)勢種群、病原菌種群的變化趨勢，研制木霉菌新的生物制劑，會對人參病害的發(fā)生起到一定的預防作用，以期為克服人參連作障礙取得突破性進展。

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[14]Watanabe K，Kodama Y，Harayama S. Design and evaluation of PCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting[J]. Journal of Microbiological Methods，2001，44（3）：

2結(jié)果與分析

2.1土壤微生物總DNA提取效果檢測

土壤微生物總DNA的提取效果直接影響后續(xù)試驗，本試驗用the Power Soil DNA extraction kit試劑盒，瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖1，條帶清晰。

2.2PCR反應體系優(yōu)化

影響PCR擴增效果的因素有多種，但DNA、dNTPs、Mg2+、引物的濃度在PCR反應體系中的影響尤為重大。為

此，本試驗中采用單因素試驗對其適宜的濃度進行了優(yōu)化。（1）DNA濃度太低會降低分子碰撞的概率，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定；濃度太高會增加非專一擴增產(chǎn)物或出現(xiàn)彌散性條帶[10]。（2）dNTPs是PCR反應的原料，濃度太低會過早消耗，無法繼續(xù)合成DNA，濃度太高會導致非特異性擴增[11]。（3）Mg2+的主要作用是提高Taq酶的活性，適量的濃度會提高PCR的擴增效率，濃度過低會降低Taq酶的活性，擴增產(chǎn)物少甚至擴不出來，濃度太高會形成金屬螯合物，不利于PCR的進行[12]。（4）引物濃度太低擴增產(chǎn)物太少，太高會導致非特異性擴增或引物之間形成二聚體[13-14]。

2.3PCR-DGGE反應體系優(yōu)化

要獲得區(qū)分不同樣品的最大分辨率的DGGE圖譜，合理的凝膠梯度、變性劑梯度及電泳時間十分重要。利用合理的

3討論與結(jié)論

PCR-DGGE反應涉及諸多因素，每個因素的反應參數(shù)對整個體系的穩(wěn)定性和重復性都有影響，確定合適的反應參數(shù)是確保土壤微生物分析準確的前提。本試驗采用單因素變化設(shè)計，對各主要影響因素（模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度）進行優(yōu)化，得到人參根際土壤微生物PCR-DGGE反應體系優(yōu)化結(jié)果：25反應體系中DNA濃度52.5 ng、dNTPs濃度0.20 mmol/L、Mg2+濃度1.50 mmol/L、引物濃度4.8 μmol搭配效果最佳。

本試驗中細菌DGGE圖譜可以看出每個樣品均可分離出較多的條帶，其中不同的條帶代表不同細菌的基因片段，說明每個樣品都存在著豐富的細菌種類，并且每個樣品的分離條帶差異不明顯。真菌DGGE圖譜可以看出根際真菌與非根際真菌種類存在明顯差異，并且真菌種類隨著種植年限的增加而變少。人參的種植年限越高，其根際優(yōu)勢種群越少，病害越易發(fā)生，所以，真菌群落的動態(tài)變化與病害的發(fā)生存在著直接的關(guān)系。

DGGE指紋圖譜能夠直觀地反映根際微生物的變化，它是一種能夠提供微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究方法，為了進一步分析其多樣性，還需要對DGGE條帶進行切膠回收、克隆測序，后續(xù)試驗正在進行當中。另外，利用基因組學、蛋白質(zhì)組學等方法，對木霉菌、病原菌、人參三方的互作關(guān)系進行進一步研究，了解群落中占優(yōu)勢種群、病原菌種群的變化趨勢，研制木霉菌新的生物制劑，會對人參病害的發(fā)生起到一定的預防作用，以期為克服人參連作障礙取得突破性進展。

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