付強(qiáng)++鐘曉武鄒頡+林世鋒+郭玉雙+趙杰宏+王軼+任學(xué)良

摘要：為了研究煙草中重金屬鎘的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)基因，以馬鈴薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1（PCS1）基因的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AJ548472.1）為信息探針，通過(guò)電子克隆的方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并對(duì)其進(jìn)行了序列分析。序列分析結(jié)果：NtPCS1包含完整的開(kāi)放讀碼框，編碼531個(gè)氨基酸，含有2個(gè)保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin；通過(guò)同源比對(duì)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，NtPCS1氨基酸序列與番茄PCS1的序列一致性達(dá)到85%，與已報(bào)道的樹(shù)煙草NgPCS相比，在N端多出30個(gè)氨基酸。以上結(jié)果表明NtPCS1是栽培煙草中新發(fā)現(xiàn)的金屬鎘代謝轉(zhuǎn)運(yùn)基因。

關(guān)鍵詞：栽培煙草；植物螯合肽合成酶；鎘轉(zhuǎn)運(yùn)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785；S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0034-04

收稿日期：2013-09-11

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合NY字[2011]3047號(hào)）；中國(guó)煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：中煙辦[2010]221號(hào)）；中國(guó)煙草總公司重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：中煙辦[2012]146號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：付強(qiáng)（1984—），男，貴州赤水人，博士，助理研究員，主要從事煙草遺傳育種與蛋白質(zhì)組學(xué)研究。E-mail：nesta1984fu@sina.com。

通信作者：任學(xué)良，男，博士，研究員，研究方向?yàn)闊煵莼蚪M學(xué)。E-mail：renxuel@126.com。當(dāng)環(huán)境受到鎘污染后，鎘便在生物體內(nèi)富集，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體而引起慢性中毒。鎘被人體吸收后，可在人體內(nèi)形成鎘硫蛋白，并選擇性地蓄積在肝、腎中，其中腎臟可吸收近1/3，是鎘中毒的“靶器官”。鎘在人體內(nèi)的生物半衰期達(dá)到30年之久，往往會(huì)引起慢性毒性[1]。通過(guò)對(duì)我國(guó)煙葉主產(chǎn)區(qū)的重金屬含量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鎘是我國(guó)煙葉中的主要重金屬元素，含量遠(yuǎn)高于鉛、汞、砷等，平均含量達(dá)到2.95 mg/kg[2]。隨著人們對(duì)健康生活關(guān)注度的提高，煙草中鎘含量已經(jīng)成為煙草行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。

煙草中的鎘來(lái)源于土壤，即便是在鎘污染不是很?chē)?yán)重的土壤中，煙草仍然能夠通過(guò)根吸收鎘，然后被吸收的鎘再通過(guò)一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入煙草的各個(gè)組織，從而導(dǎo)致鎘在煙草中大量富集；此外，植物中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅、鐵金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也有運(yùn)輸鎘的功能[3]。植物螯合肽（phytochelatins，PCS）是一種谷胱甘肽衍生的金屬結(jié)合肽，在多種植物中扮演著解除鎘和砷毒性的作用，近期的研究報(bào)道，植物螯合肽參與鎘在韌皮部中的長(zhǎng)距離運(yùn)輸。植物螯合肽的形成需要植物螯合肽合成酶的催化，而植物螯合肽合成酶基因已經(jīng)成功在植物、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)中得到克隆[4-8]。但是植物螯合肽在栽培煙草中是否存在仍然未知，并且如果在煙草中存在，其在鎘代謝過(guò)程中扮演的角色也值得研究。

電子克隆（in silico cloning）是近年來(lái)伴隨著基因組計(jì)劃和 EST 計(jì)劃而發(fā)展起來(lái)的新的基因克隆方法[9-12]，其技術(shù)核心是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長(zhǎng)cDNA序列。本研究采用電子克隆的方法獲得了1個(gè)植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究煙草中鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究中所用煙草的基因序列均由GenBank提供。

1.2煙草PCS1基因的電子克隆

以馬鈴薯的phytochelatin synthases 1（PCS1）基因全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AJ548472.1）為信息探針[13]，對(duì)GenBank中EST_others數(shù)據(jù)庫(kù)的普通煙草（Nicotiana tabacum）進(jìn)行BLAST檢索，并參考菲莫公司的林煙草和絨毛狀煙草的全基因組測(cè)序結(jié)果[14]，使用Codon Code Aligner軟件對(duì)檢索到的來(lái)自美國(guó)普通煙草的全部EST序列進(jìn)行拼接，形成重疊群（contig）。利用拼接獲得的重疊群作為探針，再次進(jìn)行同源檢索、拼接。重復(fù)以上過(guò)程直至沒(méi)有更多的EST被檢出，最終獲得美國(guó)普通煙草的PCS1 cDNA序列，最后再用此序列片段在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析與其他物種同源基因的相似性和一致性，檢驗(yàn)拼接所得cDNA片段的正確性以及讀碼框（open reading frame，ORF）序列的完整性。

1.3煙草PCS1基因的生物信息學(xué)分析

序列比對(duì)、ORF查找和翻譯均在 NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的相應(yīng)模塊上完成。利用 ExPASy 網(wǎng)站上的Prot-Param、pI/Mw操作對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行基本分析；利用在線(xiàn)資源SignalP 4.1、TargetP 1.1、NetOGlyc 4.1、NetNGly 1.0、NetPhos和SOPMA軟件進(jìn)行信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析；利用clustalX 2.0、MEG A4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1煙草栽培品種PCS1基因的電子克隆

利用馬鈴薯PCS1基因的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AB559522）為檢索探針，對(duì)GenBnak中的煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索分析，同時(shí)比對(duì)菲莫公司2013年發(fā)布的煙草基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[14]，發(fā)現(xiàn)18條一致性和相似性較高的EST序列。按照“1.1”所述方法進(jìn)行重疊群分析，結(jié)果顯示，18條EST可拼接成1條獨(dú)立的cDNA序列，長(zhǎng)度為1 596 bp，暫命名為NtPCS1（Nicotiana tabacum PCS1））。

2.2NtPCS1蛋白的基本參數(shù)和可能的翻譯后修飾

NtPCS1蛋白的長(zhǎng)度為531個(gè)氨基酸，分子量為

58.36 kDa，等電點(diǎn)（pI）為 6.44。在氨基酸組成上，酸性氨基酸（天門(mén)冬氨酸+谷氨酸）有56個(gè)，占10.5%；堿性氨基酸（賴(lài)氨酸+精氨酸）有52個(gè)，占9.7%；含量最豐富的為亮氨酸（Leu），占總氨基酸的11%，其次是絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala），分別占8.9%、8.1%。NCBI保守域檢測(cè)表明，NtPCS1蛋白含有 2 個(gè)保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin，說(shuō)明所克隆的NtPCS1 基因是植物螯合肽合成酶基因家族成員）。分析還表明：NtPCS1蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為41.79，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為88.53，總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.087，具有輕度疏水性。采用 SignalP 4.1對(duì)NtPCS1蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)[15]表明，NtPCS1蛋白無(wú)信號(hào)肽。利用TargetP1.1在線(xiàn)軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)推導(dǎo)蛋白的定位特性分析[16]顯示，NtPCS1 沒(méi)有特殊的定位偏好性。用NetOGly 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGly 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，NtPCS1 沒(méi)有信號(hào)肽，即便是具有5個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，也不會(huì)發(fā)生O-連接糖基化，但是在第64、154、323位氨基酸可能發(fā)生N-糖基化，這3個(gè)糖基化位點(diǎn)位于NtPCS1蛋白質(zhì)的保守功能結(jié)構(gòu)域里，對(duì)蛋白的功能可能起著重要作用。NetPhos2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)表明，NtPCS1蛋白存在20個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其潛在的Ser、Thr、Tyr活性位點(diǎn)數(shù)分別為 14、4、2個(gè)。NtPCS1蛋白存在著豐富的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)PCS家族的蛋白活化起著重要作用。

2.3NtPCS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA方法預(yù)測(cè)的NtPCS1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示?？梢钥闯?，參與α-螺旋的氨基酸含量達(dá)到501%（266 個(gè)）；177 個(gè)氨基酸可能參與形成無(wú)規(guī)則卷曲，占33.3%；另外有55個(gè)氨基酸可能參與延伸鏈，占10.4%；33個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占6.2%。以上分析表明，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是NtGT5a蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)。

2.4NtPCS1基因同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了分析NtPCS1與其他植物的植物螯合肽合成酶基因的同源性，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)NtPCS1進(jìn)行了BLASTN。結(jié)果表明，NtPCS1與番茄的StPCS1、StPCS18、StPCS16、StPCS19和山萵苣的LsPCS1基因具有較高的核苷酸序列同源性，說(shuō)明該基因應(yīng)該是一個(gè)與重金屬離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的新基因。同時(shí)BLASTP分析發(fā)現(xiàn)，NtPCS1所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與番茄同源基因的氨基酸相似性最高，達(dá)到85%以上；與樹(shù)煙草相比，NtPCS1在N端多出30個(gè)氨基酸[4]。另外研究表明，NtPCS1與葡萄、蓖麻、可可、楊樹(shù)、大豆、擬南芥的植物螯合肽合成酶基因也有較高的同源性，同源性分別為73%、68%、68%、67%、63%、60%。從GenBank上獲得的多個(gè)植物PCS同源基因編碼蛋白的氨基酸序列，經(jīng)過(guò)clustalX 2.0比對(duì)后生成aln比對(duì)文件，然后利用進(jìn)化分析軟件MEGA 4.0，并采用中鄰位相接（Neighbor-Joint）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[17-18]。分析結(jié)果表明，栽培煙草中的PCS蛋白與茄科植物PCS基因編碼蛋白的進(jìn)化關(guān)系更近；而在同科植物中，與樹(shù)煙草、番茄和馬鈴薯的同源基因相比，煙草栽培品種的PCS蛋白與樹(shù)煙草的PCS蛋白同源性更高，在進(jìn)化關(guān)系上更近。

3結(jié)論與討論

許多研究表明，植物螯合肽在植物解除重金屬的毒性方面具有重要作用。Grill等早在1987年發(fā)現(xiàn)，在10多種高等植物中，PCS能結(jié)合植物所吸收的90%鎘[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PCS通過(guò)與植物根部吸收的鎘形成復(fù)合物，能夠減少鎘離子對(duì)植物的毒害，從而增強(qiáng)植物抵抗鎘脅迫的作用。

相較于其他高等植物，煙草具有更強(qiáng)的鎘吸收累積特性，這與煙草對(duì)污染土壤中鎘脅迫產(chǎn)生的耐性有關(guān)。Davis的研究表明，當(dāng)土壤鎘含量為69mg/kg時(shí)，煙草植株中鎘的含量

是菠菜、萵筍的3倍[20]。煙葉中的重金屬含量是由其生存的土壤中帶入，而不是在生產(chǎn)加工過(guò)程中人為添加，而土壤中的鎘、鎳、鉛等重金屬元素的含量和pH值是呈負(fù)相關(guān)的，因此土壤越酸，重金屬的含量也就越多。西南地區(qū)是我國(guó)酸雨最嚴(yán)重的地區(qū)，貴州的貴陽(yáng)、都勻等地的酸雨量則更為嚴(yán)重，1982年都勻城區(qū)曾監(jiān)測(cè)到降水pH值為3的驚人記錄，因此這些地方的重金屬含量有可能較高。吸煙時(shí)重金屬對(duì)人體的危害，大大高于消化道的吸收量，因?yàn)樵谙銦煵煌耆紵龝r(shí)即發(fā)生了一系列熱分解與熱合成化學(xué)反應(yīng)，燃燒時(shí)的高溫便將煙草中的重金屬、類(lèi)金屬衍變?yōu)闊焿m和霧（氣溶膠），并直接由人體呼吸道進(jìn)入體內(nèi)，該過(guò)程包含了吸煙者和被動(dòng)吸煙者，因此煙草中鎘含量已經(jīng)成為健康等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道在植物中表達(dá)與PCS1合成途徑相關(guān)酶的基因，能夠增加PCS1的含量，并且提高植物對(duì)重金屬的抗性和累積量[21]。本研究通過(guò)電子克隆方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），為利用此基因培育低鎘富集的植物奠定理論基礎(chǔ)。

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