李 狀 劉嬋楨

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧市 530021)

胸腺五肽對宮頸癌免疫調(diào)節(jié)作用的體外實驗研究▲

李 狀 劉嬋楨*

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧市 530021)

目的研究胸腺五肽對于宮頸癌局部免疫抑制的調(diào)節(jié)作用。方法宮頸癌HeLa細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清濃縮后，對其中重要的免疫抑制因子TGF-β1和VEGF進(jìn)行定量，作為宮頸癌免疫抑制微環(huán)境模型，刺激正常志愿者的淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。結(jié)果宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清導(dǎo)致正常志愿者淋巴細(xì)胞中免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯增多，樹突狀細(xì)胞成熟受阻，而于其中加入胸腺五肽后則使該現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)。結(jié)論胸腺五肽在宮頸的局部應(yīng)用可通過局部免疫調(diào)節(jié)，阻礙宮頸癌的進(jìn)展，值得臨床研究推廣。

宮頸癌；胸腺五肽；免疫抑制

宮頸癌是全世界婦女發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤，每年全球大約有53萬新發(fā)病例，27萬死亡病例，其中80%的新增病例和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。在我國，每年新發(fā)病例約13萬人，占世界新發(fā)病例的28.8%，發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，宮頸癌的治療面臨著更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前雖沒有證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生與機(jī)體的免疫狀態(tài)有必然的直接因果關(guān)系，但腫瘤的發(fā)展卻與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)：一方面，腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為弱的免疫原性，可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答，但由于其免疫原性不夠強(qiáng)，不足以激發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)；另一方面，腫瘤細(xì)胞通過分泌免疫抑制因子對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。因此，免疫調(diào)節(jié)治療是傳統(tǒng)常規(guī)治療的有益補(bǔ)充。本文應(yīng)用體外研究方法，探討如何更好地應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)治療方法以延緩宮頸癌的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及上清收集制備 人宮頸腺癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞為廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院實驗研究部保存，于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibico，美國)中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底80%左右，棄去完全RPMI1640培養(yǎng)基，然后于每瓶中加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基8 ml/瓶，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后收集培養(yǎng)上清，集中超濾濃縮50倍。

1.2 測量方法 雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗測量HeLa上清中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF 水平，上述酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒購自深圳欣博盛公司，并經(jīng)預(yù)實驗證明。將HeLa培養(yǎng)上清中調(diào)節(jié)終濃度VEGF約6 ng/mL、TGF-β約1 300 pg/mL可穩(wěn)定誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞發(fā)生變化。

1.3 分離及誘導(dǎo) 健康志愿者外周血經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(GE公司，美國)分離為淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞，其中單核細(xì)胞用于誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞。誘導(dǎo)所需的重組人IL-4、重組人IL-6、重組人腫瘤壞死因子TNF-α、重組人γ干擾素IFN-λ購自以色列Peprotech公司，PGE2購自美國Sigma公司。

1.4 免疫檢測 流式細(xì)胞分析術(shù)檢測淋巴細(xì)胞中免疫抑制性CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，測定經(jīng)誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞中CD83陽性成熟樹突狀細(xì)胞及CD1a陽性不成熟樹突狀細(xì)胞的比例；其中所需的各種抗體購自美國BD公司。

1.5 胸腺五肽處理方法 將胸腺五肽注射液( 商品名：通達(dá)，北京市世橋生物制藥有限公司)1 mg/mL加入研究體系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胸腺五肽對淋巴細(xì)胞的免疫影響 胸腺五肽對于正常志愿者淋巴細(xì)胞中免疫抑制性CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響表現(xiàn)：當(dāng)健康志愿者淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中含終濃度VEGF>6 ng/mL、TGF-β1>300 pg/mL的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清時，CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例較加入等比例濃縮的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的對照組顯著增高，而在此基礎(chǔ)上再加入1 mg/mL胸腺五肽注射液，則CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例回落。對照組、HeLa上清組及胸腺五肽組CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別為(16±2.6)%、(47±6.4)%、(21±3.3)%，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 CD4+CD25+FoxP3+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例

2.2 胸腺五肽對樹突狀細(xì)胞成熟的影響 當(dāng)健康志愿者樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)體系中含終濃度VEGF>6 ng/mL、TGF-β1>300 pg/mL的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清時，CD83+成熟DC比例較加入等比例濃縮的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的對照組顯著降低，而CD1a不成熟DC比例則顯著增高，而在此基礎(chǔ)上再加入1 mg/mL胸腺五肽注射液，則CD83+成熟DC比例回升而CD1a+不成熟DC比例回落。對照組、HeLa上清組及胸腺五肽組CD83+成熟DC比例分別為(41±5.4)%、(7±5.6)%、(36±4.9)%，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組、HeLa上清組及胸腺五肽組CD1a不成熟DC比例分別為(5.1±1.3)%、(9±2.3)%、(5.4±1.1)%，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 CD83+成熟DC及CD1a+不成熟DC比例

3 討 論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)最早于1979年由Lord正式提出，即是腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等共同組成。腫瘤細(xì)胞通過自分泌-旁分泌途徑能分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，使腫瘤局部形成一個深度免疫抑制區(qū)，不僅使身在其中的免疫細(xì)胞功能受到嚴(yán)重抑制，甚至功能正常、活化的免疫細(xì)胞，一旦進(jìn)入此環(huán)境也將成為免疫功能抑制的“沉默”細(xì)胞，是腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制之一[2]。因此，作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在著腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用。該局部微環(huán)境包括了腫瘤組織產(chǎn)生的免疫抑制性細(xì)胞因子[3]、腫瘤組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫抑制性細(xì)胞如CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[4]、腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞[5]等多種免疫抑制因素。

腫瘤免疫抑制微環(huán)境在腫瘤發(fā)展中的作用被越來越多的研究者所重視，然而針這些研究，目前還沒有一個較為成熟的實驗?zāi)Ｐ妥鳛檠芯枯d體。因此如何建立一個合理而穩(wěn)定的研究模型，為后期的研究打下堅實的實驗基礎(chǔ)是我們首要考慮的問題。為此，我們借鑒浙江大學(xué)謝幸教授用卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清研究卵巢癌免疫抑制微環(huán)境的思路[6]，用宮頸癌HeLa細(xì)胞體外培養(yǎng)上清以模擬宮頸癌局部微環(huán)境，通過測量其中免疫抑制因子水平并進(jìn)一步對該微環(huán)境模型進(jìn)行均一化，發(fā)現(xiàn)以TGF-β1、VEGF為代表的免疫抑制因子出現(xiàn)明顯升高，并可刺激免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯升高，CD83+成熟樹突狀細(xì)胞比例降低，CD1a+不成熟樹突狀細(xì)胞比例升高，因此表明該體外環(huán)境滿足產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子、誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫抑制性細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞等相關(guān)條件，可以模擬體內(nèi)的宮頸癌免疫抑制微環(huán)境，在此基礎(chǔ)上可研究藥物對于宮頸癌免疫抑制微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步尋找改善腫瘤局部免疫抑制狀態(tài)的臨床治療手段。

胸腺肽是由胸腺的組織上皮細(xì)胞分泌的一類多肽激素， 可促進(jìn)T 細(xì)胞的成熟，同時參與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的交互作用，激活細(xì)胞免疫。其中的胸腺肽α1可刺激外周血液淋巴細(xì)胞絲裂原，促進(jìn)載淋巴細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)抗原或絲裂原激活后載細(xì)胞分泌的干擾素-α、干擾素-γ 以及白細(xì)胞介素-Ⅱ、白細(xì)胞介素-Ⅲ等淋巴因子水平，同時增加T 細(xì)胞表面淋巴因子受體水平。胸腺肽α1 還可通過對CD4細(xì)胞的激活，增強(qiáng)異體和自體的人類混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。因此，胸腺肽有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫功能的作用[7]。但對于局部腫瘤免疫抑制微環(huán)境是否有改善作用尚無研究。因此，我們借助上述研究模型，將商品化胸腺五肽注射液添加至其中以模擬宮頸癌局部注射治療，發(fā)現(xiàn)胸腺五肽可以對抗宮頸癌局部微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞因子，降低免疫抑制性細(xì)胞及腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞，主要是降低其中免疫抑制性的CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而保證有功能Th細(xì)胞比例，并使樹突狀細(xì)胞易于誘導(dǎo)成熟，發(fā)揮其抗原提呈作用，打破進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞而成為功能抑制的“沉默”細(xì)胞狀態(tài)，從而打破腫瘤免疫逃逸，發(fā)揮局部免疫調(diào)節(jié)作用。因此，作為輔助治療手段，胸腺五肽于宮頸局部注射，配合宮頸癌局部放療及全身化療，值得臨床進(jìn)行深入地研究。

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Invitrostudyofimmuneregulationfunctionofthymopentinincervicalcancer

LIZhuang,LIUChanzhen

(AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,Guangxi,P.R.China)

ObjectiveTo study local immune suppression regulation function of thymopentin in cervical cancer.MethodsHeLa cells cultured in serum-free supernatant was concentrated and quantified on important immunosuppressive factors TGF-β1 and VEGF as cervical cancer immunosuppressive microenvironment model to stimulate normal volunteers lymphocytes and dendritic cells.ResultsCulture supernatant of cervical cancer HeLa cell caused normal volunteers′ immunosuppressive CD4+ CD25+ FOXP3+ regulatory T cells increased significantly, dendritic cell maturation blocked. Adding thymopentin made the phenomenon reversed.ConclusionTopical application of thymopentin in cervix impedes the progress of cervical cancer by local immune regulation, and it is worthy of clinical popularization.

Cervical cancer; Thymopentin; Immunosuppression

廣西自然科學(xué)基金(合同號：2013jjBA40189)

李狀(1986～)，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

R 737.33

A

1673-6575(2014)05-0549-04

10.11864/j.issn.1673.2014.05.05

2014-06-23

2014-08-20)

*通訊作者