莫雨平，鄧曉豐，紀倩，滕金艷，姚海江，宋洪濤，唐銀杉，許安萍，張淑靜，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

抑郁癥是一種情緒障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為心境低落，軀體不適和睡眠障礙等持久的抑郁狀態(tài)，明顯影響患者日常生活及社會功能。世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測到2020年抑郁癥將成為全球第二大威脅人類健康、增加經(jīng)濟負擔的疾患［1］。慢性應(yīng)激模型作為一種有效的抑郁模型，已被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的基礎(chǔ)研究和各種治療方法篩選［2］。細胞因子同神經(jīng)遞質(zhì)和激素一樣，是免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間信息交流的重要信息分子，在維持機體內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)以及參與某些病理狀態(tài)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。它參與機體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)，引起抑郁樣的行為異常:如運動遲緩、睡眠障礙、厭食、體重減輕、痛覺過敏、社會退縮、性欲減低等［3］。為此，本研究擬通過孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)復(fù)制抑郁癥模型并運用電針進行干預(yù)，通過免疫組織化學法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞因子IL－1β、IL－6在大鼠海馬及血清中的表達情況，以探討IL－1β、IL－6在大鼠實驗性抑郁癥發(fā)病過程中的作用機制及電針干預(yù)對其影響，為臨床診斷和防治抑郁癥提供新的途徑及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

成年SD大鼠，雄性，60只，體質(zhì)量(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證號:SCXK(京)2012－0001)。溫度(25±2)℃，濕度(50±20)%，自然光照，自由進食、進水(除實驗要求禁食禁水外)。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后采用開野試驗、糖水試驗及體質(zhì)量測量進行行為學評分，選取得分相近的SD大鼠60只，隨機分為5組，每組12只，正常組6只/籠飼養(yǎng)，正常飲食，不給予任何刺激;模型組1只/籠孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激。

1.2 實驗儀器試劑

Thermo離心機(美國);Thermo酶標儀(美國);百憂解(美國禮來公司，20mg，批號J20030017);IL－1β、IL－6抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白IgG及SP試劑盒(北京中山生物科技公司);DAB顯色試劑盒(北京中山生物科技公司);枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PBS緩沖液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);上海朗頓酶聯(lián)免疫試劑盒。

華佗牌無菌針灸針(0.30×25mm，天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司);LH202型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京大學神經(jīng)科學研究所監(jiān)制，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);ZJ－12H音樂電針治療儀(中國針灸學會研制，深圳市圣祥高科技有限公司)。

2 方法

2.1 孤養(yǎng)結(jié)合CUMS模型的建立

本實驗采用多種不可預(yù)知的刺激方法交替進行，以避免大鼠對單一或有規(guī)律的應(yīng)激刺激產(chǎn)生耐受性，隨機接受21天7種不同的應(yīng)激刺激，平均每種刺激3次。包括禁食(24h)、禁水(24h)、潮濕環(huán)境(24h)、冷水游泳(10℃，5min)、夾尾(距尾尖 2cm，5min)、電擊(100V，2mA，5min)、搖晃(1 次/s，15min)。

2.2 各組干預(yù)方法

步驟參考本課題組前期研究結(jié)果［4－6］。

2.3 開野試驗

敞箱長×寬×高(100cm×100cm×50cm)，內(nèi)側(cè)四周壁及箱底面均為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25方格。操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果［4－6］，但將觀察時間由 3min 延長至5min。

2.4 免疫組織化學法檢測大鼠海馬IL－1β、IL－6表達情況

具體操作步驟嚴格按照說明書進行，一抗抗體濃度 IL －1β(1∶50)、IL －6(1∶100)。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清IL－1β、IL－6表達量

大鼠于鍘刀快速斷頭，離心管取血，室溫下靜置20min，待血液凝固后4℃低溫高速離心機4000rpm/min離心10min，移液器分離血清至1.5ml的離心管，－80℃冰箱保存，待測。嚴格按照上海朗頓酶聯(lián)免疫試劑盒操作步驟進行大鼠血清IL－1β、IL－6檢測。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠開野實驗結(jié)果比較

如圖1所示，21天應(yīng)激刺激后，與空白組比較，模型組水平運動及垂直運動均明顯減少(P＜0.01)，說明造模成功。與模型組比較，百憂解組與兩個電針組活動度均明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，說明百憂解和兩種電針均有抗抑郁作用。

3.2 各組大鼠血清IL－1β、IL－6表達情況比較

如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠血清IL－1β、IL－6表達水平升高(均 P ＜0.01);與模型組比較，百憂解組、電針組(P＜0.05)、音樂電針組IL－1β表達水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，但三個治療組之間無統(tǒng)計學差異。與模型組比較，百憂解組IL－6表達水平有明顯下調(diào)趨勢(P＜0.01)，電針組與音樂電針組IL－6表達也呈現(xiàn)下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異，三個治療組之間的差異也無統(tǒng)計學意義。

3.3 各組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達情況比較

如圖3所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達水平升高(均 P ＜0.01);與模型組比較，百憂解組(P＜0.05)、電針組、音樂電針組IL－1β表達水平下調(diào);與百憂解組比較，音樂電針組大鼠海馬內(nèi)IL－1β下調(diào)幅度稍低(P≤0.05)。與模型組比較，百憂解組 IL－6表達水平有下調(diào)趨勢(P＜0.05)，電針組與音樂電針組IL－6表達也呈現(xiàn)下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異，三個治療組之間的差異也無統(tǒng)計學意義。

圖1 各組大鼠開野實驗水平運動及垂直運動次數(shù)比較(s，n=12)

圖2 各組大鼠血清IL－1β、IL－6表達情況比較(s，n=6)

4 討論

本實驗采用孤養(yǎng)與CUMS結(jié)合的方法復(fù)制抑郁模型，具有應(yīng)激因子多變及不可預(yù)見的特點，與人類抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機制較為接近。應(yīng)激后模型組大鼠活動減少，探索興趣降低，說明抑郁癥模型復(fù)制成功，經(jīng)典陽性藥百憂解及兩組電針均能逆轉(zhuǎn)此變化，有抗抑郁的作用，可進行下一步機制分析。

海馬與學習、記憶、行為和情緒關(guān)系密切，也是應(yīng)激損傷的重要靶點［7］。細胞因子是一類主要由活化免疫細胞分泌的具有重要生物學特性的小分子蛋白或多肽，是神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)節(jié)因子［8］。細胞因子除了介導免疫細胞互相傳遞信息外，還可能在抑郁癥發(fā)病機制中起重要作用。Owen等［9］發(fā)現(xiàn)，抑郁癥與IL－1β產(chǎn)生增加相關(guān)，并且他認為是抑郁導致IL－1β增加，IL－1β是抑郁癥的一個特異性指標。因為無論是心因性還是軀體反應(yīng)性抑郁，外周和中樞的IL－1β增加和炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的激活，都可引起抑郁癥狀或抑郁癥。Maes等［10］認為，各種免疫反應(yīng)和急性期反應(yīng)的基礎(chǔ)是單核細胞分泌IL－6的增加，同時還可導致HPA軸活動過度及5－HT代謝障礙，進而出現(xiàn)疾病癥狀(如嗜睡、乏力、食欲減退、抑郁等)和植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如出汗、心慌等)。Kagaya等［11］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血漿中的 IL－1β、IL－6濃度均顯著高于正常健康人;蔡巍等［12］研究報道，抑郁癥患者血清中IL－1β、IL－6水平較正常健康人要明顯升高，經(jīng)過治療后，隨著患者癥狀的改善，相應(yīng)的細胞因子水平也下降，進一步說明細胞因子的激活可能是抑郁癥發(fā)病原因之一［13－15］。

圖3 各組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達情況比較(s，n=6)

中醫(yī)學認為，抑郁癥發(fā)病的病機是臟氣受損，髓海虧虛，神機紊亂。印堂、百會為督脈之穴，督脈行于身后，循脊入腦，其布在身，其用在神，其本在腦，本著“經(jīng)脈所過，主治所及”，選取督脈治療與腦相關(guān)的神志病符合中醫(yī)治病必求其本之說。此外，印堂穴具有調(diào)神醒腦的功效，百會穴為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)交會之穴，選取該兩穴來治療抑郁癥，可以調(diào)節(jié)其髓海機能，增進其“五臟化氣”的生理功能，使其紊亂的神機恢復(fù)正常，以達到抗抑郁的效果［4－6］。

電針療法是在我國傳統(tǒng)針灸治療基礎(chǔ)上發(fā)展而來，脈沖電針儀發(fā)出周期性重復(fù)的波形，用以加強針感，具有針刺和電場的雙重作用，但在治療后期因機體對其適應(yīng)而出現(xiàn)效果衰減，這一直是困擾電針的一大難題［16－17］。為了徹底擺脫脈沖電針的弱點，更好地提高電針服務(wù)臨床的療效，波型參差不齊但均和諧的音樂電針儀應(yīng)運而生，音樂電針就是將電針治療與音樂治療兩者合而為一的方法，克服了機體耐受這一缺點［16－17］。另外，音樂也具有鎮(zhèn)靜、安神、舒緩情緒的作用?！秲?nèi)經(jīng)》中說“五臟之象，可以類推，五臟相音，可以意識”。古人在長期的實踐及體驗中，發(fā)現(xiàn)音樂與臟氣之間有共鳴、互動的關(guān)系，不同調(diào)式的音樂分別影響著人體相應(yīng)的臟腑。音樂電針的處方即是運用了中醫(yī)陰陽五行學說，以五音應(yīng)五臟及“五音療疾”的原理創(chuàng)作而成，便于辨證施“樂”［4－6］。

本實驗結(jié)果顯示，兩種電針療法在改善抑郁模型大鼠行為學方面與百憂解療效一致，說明電針治療抑郁模型大鼠效果不輸于經(jīng)典抗抑郁藥物;抑郁大鼠血清及海馬內(nèi)IL－1β、IL－6的含量高于正常組，兩組電針組與百憂解組均能下調(diào)IL－1β、IL－6的含量，改善模型大鼠抑郁狀態(tài)，但兩組電針組無統(tǒng)計學差異。分析原因如下:大鼠與人相比，屬低級動物，音樂電針的音樂治療對其效果不突出，只是頻率和波形較普通脈沖電針有所區(qū)別，僅僅克服了普通脈沖電針容易造成患者耐受或穴位不敏感這一缺點，音樂治療的優(yōu)勢并未充分體現(xiàn)。若將實驗設(shè)計于臨床展開，音樂電針的治療作用可能會更加突顯。作為危害人類身心健康的高發(fā)病率、常見病種之一的抑郁癥，病程長，易復(fù)發(fā)等是其特點，目前主要以藥物治療或控制為主。但臨床常用的抗抑郁藥物抗抑郁譜窄，毒副作用大。而電針治療抑郁癥是立足于整體調(diào)節(jié)，副作用低，可以作為治療抑郁癥的方法逐漸應(yīng)用臨床。

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