馮宇飛，井中旭

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目前，臨床上報(bào)道的中藥注射劑的不良反應(yīng)癥狀多為皮疹、頭暈、頭痛、發(fā)熱、心慌、胸悶、水腫、休克等癥狀［1］，多在用藥后30min內(nèi)出現(xiàn)，上述過敏癥狀可歸屬為急性過敏反應(yīng)。多數(shù)學(xué)者將急性過敏反應(yīng)分為Ⅰ型超敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)，前者由IgE介導(dǎo)，需多次致敏后激發(fā)才會(huì)產(chǎn)生過敏樣癥狀，而后者癥狀的產(chǎn)生與IgE無關(guān)，且首次接觸即可發(fā)生反應(yīng)，二者臨床癥狀類似，但作用機(jī)理完全不同［2］。為了探討刺五加注射液致敏反應(yīng)類型，建立可靠、靈敏的致敏物質(zhì)篩選方法，尋找防治刺五加注射液不良反應(yīng)的途徑和方法，本實(shí)驗(yàn)通過對刺五加注射液豚鼠致敏后血清總IgE、IL－4、IFN－γ水平、全血嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量的測定，同時(shí)對各組致敏后豚鼠經(jīng)抗原激發(fā)后的肺組織進(jìn)行病理切片檢查，確定刺五加注射液的過敏反應(yīng)類型，為進(jìn)一步研究其致敏物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試藥與儀器

刺五加注射液(×××藥廠提供，批號20100208、20100309、20100402、20100601、20100702、20100903);弗氏完全佐劑(Sigma公司進(jìn)口分裝);弗氏不完全佐劑(Sigma公司進(jìn)口分裝);卵白蛋白(Sigma公司進(jìn)口分裝);高速低溫離心機(jī)(日本日立公司，R21型);渦旋混勻器(蘇州捷美電子有限公司，HYQ－2121A型);豚鼠總IgE試劑盒;豚鼠IL－4試劑盒;豚鼠INF－r試劑盒;全自動(dòng)生化分析儀(EBS－240型，淄博恒拓分析儀器有限公司);酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司，SPECTRAMAX 190型);透射電鏡(TECNAI G2型，荷蘭);高速冷凍離心機(jī)(TGL16M型，長沙)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

白毛豚鼠，英國種，雌雄兼用，體質(zhì)量(280±30)g，清潔級，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心提供，合格證號為SCXK(黑)2008004號。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將豚鼠隨機(jī)分組，分別為陰性對照組(NS組)、陽性對照組(OVA 1mg/只)、刺五加注射液凍干粉(自制)6 個(gè)批號下分設(shè)低、高(15.4mL/kg、61.6mL/kg)兩個(gè)劑量組，每組6只。

3.2 致敏及抗血清制備

豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，將各組實(shí)驗(yàn)藥物與弗氏佐劑以1:1混合，研磨均勻后分別注射于足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、頜下、耳后等處，給藥總體積為1mL/只，致敏途徑為皮下注射，隔日1次，共免疫3次。每組分別于末次致敏后14天，心臟取血，室溫自然凝 固，6000rpm/min、離 心 20min，分 離 血 清，置－20℃冰箱備用。

3.3 豚鼠血清中總IgE水平的測定

采用豚鼠ELISA總IgE測定試劑盒，雙抗夾心法對豚鼠抗血清中總IgE水平進(jìn)行測定，記錄各組OD值，具體步驟如下:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔先加待測樣本，再加樣本稀釋液，空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豚鼠IgE抗體工作液，37℃，60min。棄去液體，甩干，不用洗滌。溫育60min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液，37℃避光顯色。依序每孔加終止溶液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的OD值。

3.4 致敏豚鼠血清中IL－4的測定

每孔分別加入豚鼠IL－4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，將已包被好的酶標(biāo)板充分混勻后，每孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃，60min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，濾紙上印干。每孔加入底物A、B液，置37℃暗處反應(yīng)15min。每孔加入終止液混勻。用酶標(biāo)儀在450nm測吸光度值。以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，A值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各待測樣品的A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出相應(yīng)的濃度值。

3.5 致敏豚鼠血清中IFN－γ的測定

每孔分別加入豚鼠IFN－γ標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，將已包被好的酶標(biāo)板充分混勻后，每孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃，60min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，濾紙上印干。每孔加入底物A、B液，置37℃暗處反應(yīng)15min。每孔加入終止液混勻。用酶標(biāo)儀在450nm測吸光度值。以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，A值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各待測樣品的A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出相應(yīng)的濃度值。

3.6 致敏豚鼠全血中嗜酸性粒細(xì)胞檢查

應(yīng)用全自動(dòng)生化儀對致敏豚鼠血清中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行測定，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對各組嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分析。

3.7 致敏豚鼠肺部病理切片檢查

豚鼠經(jīng)各組抗原激發(fā)后進(jìn)行解剖，取帶有一小塊支氣管的肺部切片經(jīng)過脫水、浸臘、包埋，最后HE染色，電鏡下觀察各組藥物對豚鼠致敏后所致的肺、氣管、細(xì)支管的形態(tài)學(xué)變化。

3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

記錄各組OD值及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組抗血清中總IgE、IL－4、IFN－γ水平，以(s)表示，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)果

4.1 致敏豚鼠總IgE、IL－4、IFN－γ測定結(jié)果

采用 ELISA法對各組致敏豚鼠總 IgE、IL－4、IFN－γ各項(xiàng)指標(biāo)測定，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后的結(jié)果，如表1～3所示，嗜酸性粒細(xì)胞測定結(jié)果如表4所示。與空白組相比，陽性對照組及刺五加注射液(20100702)高劑量組致敏豚鼠血清總IgE、IL－4、IFN－γ具有顯著性差異，但嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量未見顯著性差異。

4.2 病理切片結(jié)果

比較各組刺五加注射液與生理鹽水組的豚鼠肺部病理切片發(fā)現(xiàn)，批號為20100702的刺五加注射液高劑量組豚鼠肺部出現(xiàn)肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)有少量液體滲出，細(xì)支氣管腔內(nèi)有炎性滲出物，其周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤等輕微病變;而生理鹽水組肺泡壁毛細(xì)血管無明顯充血，肺泡腔內(nèi)無液體滲出，切片結(jié)果見圖1。

圖1 刺五加注射液(20100702)高劑量組致敏豚鼠肺切片(100×)

表1 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠總IgE水平比較(s，μg/mL，n=6)

表1 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠總IgE水平比較(s，μg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 IgE 水平卵白蛋白組 73.91 ±3.82*28.11 ±8.03生理鹽水組 23.65 ±5.96刺五加注射液 L 27.87 ±4.32(20100208)H 29.43 ±6.42刺五加注射液 L 29.57 ±7.84(20100309)H 29.17 ±7.53刺五加注射液 L 29.02 ±5.23(20100402)H 28.93 ±6.44刺五加注射液 L 24.61 ±4.95(20100601)H 27.05 ±5.76刺五加注射液 L 30.48 ±6.23(20100702)H 43.91 ±7.36*刺五加注射液 L 27.30 ±5.93(20100903)H

表2 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠IL－4水平比較(s，pg/mL，n=6)

表2 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠IL－4水平比較(s，pg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

水平卵白蛋白組 6.16 ±0.77組別 劑量 IL－4*生理鹽水組 3.58 ±0.53刺五加注射液 L 3.67 ±0.42(20100208)H 3.43 ±0.61刺五加注射液 L 3.57 ±0.48(20100309)H 3.77 ±0.73刺五加注射液 L 3.62 ±0.63(20100402)H 3.73 ±0.74刺五加注射液 L 3.87 ±0.93(20100601)H 3.78 ±1.00刺五加注射液 L 3.98 ±0.91(20100702)H 4.31 ±0.96*刺五加注射液 L 3.63 ±0.90(20100903)H 3.61 ±0.83

表3 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠IFN－γ水平比較(s，pg/mL，n=6)

表3 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠IFN－γ水平比較(s，pg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 IFN－γ水平卵白蛋白組 12.11 ±1.26*16.11 ±4.02生理鹽水組 16.18 ±2.31刺五加注射液 L 17.07 ±2.29(20100208)H 16.43 ±3.57刺五加注射液 L 16.49 ±3.48(20100309)H 15.97 ±3.34刺五加注射液 L 16.02 ±3.11(20100402)H 16.93 ±4.00刺五加注射液 L 16.71 ±3.58(20100601)H 17.00 ±4.67刺五加注射液 L 10.49 ±1.54(20100702)H 10.01 ±1.76*刺五加注射液 L 16.30 ±3.98(20100903)H

表4 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量比較(s，n=6)

表4 各實(shí)驗(yàn)組豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量比較(s，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量(×109)卵白蛋白組 0.51 ±0.24*0.10 ±0.03生理鹽水組 0.10 ±0.04刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100208)H 0.11 ±0.04刺五加注射液 L 0.09 ±0.01(20100309)H 0.08 ±002刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100402)H 0.08 ±0.02刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100601)H 0.10 ±0.03刺五加注射液 L 0.11 ±0.03(20100702)H 0.10 ±0.03刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100903)H

5 討論

IgE是人體五種免疫球蛋白中含量最低的，IgE介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)抗體，生理情況下含量極低，在健康人群中呈偏態(tài)分布。血清中總IgE的測定對尋找過敏原及認(rèn)定過敏反應(yīng)類型具有重要意義，可以初步認(rèn)定中藥注射劑的Ⅰ型過敏反應(yīng)。細(xì)胞因子是一大類能在細(xì)胞間傳遞信息，具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。IL－4由抗原或絲裂原刺激的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，活化的肥大細(xì)胞亦可產(chǎn)生IL－4。IFN－γ由CD8+T細(xì)胞和某些CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，NK細(xì)胞亦可合成少量的IFN－γ，IFN－γ不僅抑制TH2型細(xì)胞產(chǎn)生IL－4，而且抑制IL－4對B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。因此本研究選擇了致敏豚鼠血清中總IgE、IL－4、IFN－γ水平做為Ⅰ型過敏反應(yīng)的檢測指標(biāo)，判斷刺五加注射液的致Ⅰ型過敏反應(yīng)作用。

采用ELISA法檢測不同批次刺五加注射液致敏豚鼠后總IgE、IL－4、IFN－γ水平的變化。ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過免疫后某些批次刺五加注射液高劑量組豚鼠血清總IgE、IL－4、IFN－γ水平與生理鹽水組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。病理切片結(jié)果顯示，正常組豚鼠肺泡壁毛細(xì)血管無明顯充血，肺泡腔內(nèi)無液體滲出。某些批次刺五加注射液高劑量組豚鼠的肺部病理切片顯示，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)液體滲出、肺組織實(shí)變，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)有液體滲出，肺水腫，細(xì)支氣管腔內(nèi)有炎性滲出。推測是由于過敏反應(yīng)肥大細(xì)胞釋放的組胺增加了血管通透性導(dǎo)致炎癥反應(yīng)所致。本實(shí)驗(yàn)中，致敏豚鼠全血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與空白組相比，無顯著性差異，結(jié)合IgE、IL－4、IFN－γ水平的變化以及病理切片結(jié)果證明刺五加注射液所引起的過敏反應(yīng)符合Ⅰ型過敏反應(yīng)特征，判斷為Ⅰ型過敏反應(yīng)。

［1］馬志強(qiáng)，蔡程科，劉璐，等.凝膠色譜法對舒血寧注射液中高分子量物質(zhì)的檢查［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(3):31 －32.

［2］張玉生，史艷秋，王建華.中藥注射劑過敏反應(yīng)非臨床評價(jià)方法［J］.中草藥，2009，40(2):313－315.