李厚忠，任公平，張羽飛

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

哮喘患者肺組織經(jīng)常伴有新生血管的生成，來自哮喘患者活組織檢查發(fā)現(xiàn)不論血管的數(shù)量還是粗細(xì)都有所增加，這些改變可引起氣道阻塞或(和)氣道高反應(yīng)性，從而加重哮喘［1］。目前，治療哮喘的一般方法是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥等［2］，由于不良反應(yīng)嚴(yán)重，患者很難接受，尋找安全有效的中藥就顯得更加重要。中藥川貝治療哮喘安全可靠，可作為首選。

既往研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)在血管生成過程中起核心作用［3］。最新研究發(fā)現(xiàn)，VEGF調(diào)節(jié)血管生成是通過缺氧誘導(dǎo)因子－1α(HIF－1α)發(fā)揮作用的［4］，HIF－1α 可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)響應(yīng)氧氣濃度的變化。本研究建立哮喘小鼠模型，通過檢測(cè)氣道炎癥、血管百分比以及血管生成與VEGF和HIF－1α的關(guān)系，探討中藥川貝治療哮喘的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):P00102008。

1.2 試藥

中藥川貝粉的制備:選取整齊、粉性足者。由于川貝忌水洗，因此采用潔凈的紗布擦拭藥材表面去除藥材表面的灰塵。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15min后直接轉(zhuǎn)至粉碎車間，F(xiàn)z－400型粉碎機(jī)組加工成100目細(xì)粉，收得的細(xì)粉裝入潔凈的容器中。全部加工完后的細(xì)粉用潔凈的塑料袋分裝成1kg/袋備用。

1.3 模型建立

健康清潔級(jí)BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1ml作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日1次，每次20min，共激發(fā)28天。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸或站立不穩(wěn)等表現(xiàn)表示成功激發(fā)。將成功制備的哮喘模型小鼠(20只)隨機(jī)分為2組(每組10只)。分別為模型組和中藥川貝組，另設(shè)PBS組(10只，以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入給藥)。分組后每天灌胃給藥，模型組和PBS組給予等量生理鹽水，中藥川貝組給予川貝粉9.0g/kg，每日1次，連續(xù)28天。最后1次給藥2h后，三組小鼠用1%巴比妥鈉麻醉，取出肺組織保存，用于組織學(xué)檢測(cè)。

1.4 免疫組化法檢測(cè)VEGF和HIF－1α表達(dá)、計(jì)算血管百分比

肺組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3%H2O2中15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復(fù)抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。切片與血管性血友病因子(vWF)初級(jí)抗體孵育。VEGF和HIF－1α分別4℃過夜，隨后與二氨基聯(lián)苯胺孵育。用均勻結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞表面的vWF抗體標(biāo)記血管，所有的后續(xù)步驟均在ZSGB－BIO Autostainer進(jìn)行。隨機(jī)選定1個(gè)HPF(200×)視野，像場(chǎng)的總面積除以vWF陽(yáng)性面積既得血管百分比，免疫組化染色支氣管上皮細(xì)胞用于計(jì)算VEGF與HIF－1α表達(dá)。

1.5 Western blotting檢測(cè)VEGF與HIF－1α表達(dá)

在蛋白酶抑制劑的存在下肺組織勻漿，以獲得肺蛋白提取物，用于Western blotting分析，使用bca－100蛋白定量分析試劑盒確定濃度。每組蛋白質(zhì)等量(30μG)固定SDS聚丙烯酰胺凝膠，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，膜在三異丙基乙磺酰緩沖鹽水吐溫20(25 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，和 0.1%Tween 20)中用5%的脫脂奶粉封閉1h，與原發(fā)性抗VEGF抗體或抗－HIF－1抗體4℃過夜孵育，然后與二抗雜交(Dako，1∶2000)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯示特異性結(jié)合，以βactin為內(nèi)參，X射線掃描，計(jì)算機(jī)輔助雙向光密度計(jì)分析光密度，計(jì)算VEGF和HIF－1α表達(dá)的相對(duì)比例。

1.6 組織學(xué)分析

肺組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數(shù)字顯微鏡掃描。根據(jù)組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)支氣管周圍炎癥進(jìn)行評(píng)分:1)支氣管周圍無(wú)炎細(xì)胞;2)可見少量炎細(xì)胞;3)大量炎細(xì)胞，但是沒有完全浸潤(rùn)支氣管;4)1層炎細(xì)胞完全浸潤(rùn)支氣管;5)2層炎細(xì)胞完全浸潤(rùn)支氣管;6)3層或者更多炎細(xì)胞完全浸潤(rùn)支氣管。用所有肺組織的支氣管除以有炎癥的支氣管計(jì)算平均支氣管炎癥指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中藥川貝降低血管生成

OVA致敏后，血管生成(見圖1)。模型組血管百分比明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。給予中藥川貝干預(yù)后，血管百分比明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見表1)。

2.2 中藥川貝降低VEGF表達(dá)

模型組支氣管上皮細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯升高，中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)接近PBS組(見圖2，表1)。Western blotting結(jié)果顯示，模型組VEGF表達(dá)明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)降低，與PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖3，表1)。

圖1 小鼠肺組織vWF陽(yáng)性血管面積(200×)

圖2 小鼠肺組織VEGF表達(dá)(200×)

圖3 Western blotting結(jié)果

圖4 小鼠肺組織HIF－1α表達(dá)(400×)

表1 中藥川貝對(duì)哮喘模型小鼠血管生成的影響(n=10，s)

表1 中藥川貝對(duì)哮喘模型小鼠血管生成的影響(n=10，s)

注:與 PBS組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，※※P ＜0.01，※P ＜0.05。

模型組 中藥川貝組 PBS組血管百分比 2.82 ±0.78※※ 0.77 ±0.13＊＊1.60 ±0.15 0.42 ±0.10 VEGF 表達(dá) 93.29 ±1.55※※26.25 ±1.08＊＊ 23.08 ±2.79 VEGF 表達(dá)相對(duì)比 2.08 ±0.30※※ 1.12 ±0.22＊＊ 0.96 ±0.30 HIF －1α 表達(dá) 89.60 ±0.79※※71.70 ±1.40＊＊ 11.70 ±0.30 HIF －1α 表達(dá)相對(duì)比 0.97 ±0.30※ 0.88 ±0.47＊＊ 0.32 ±0.12平均炎癥指數(shù) 4.79 ±0.21※※ 2.91 ±0.17＊＊

2.3 中藥川貝降低HIF－1α表達(dá)

為進(jìn)一步闡明中藥川貝抗血管生成機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了肺組織HIF－1α表達(dá)水平。PBS組僅可見少量HIF－1α陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組肺泡上皮細(xì)胞核HIF－1α高表達(dá)(見圖3，圖4)。Western blotting檢測(cè)HIF－1α相對(duì)比，模型組HIF－1α表達(dá)上調(diào)，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥川貝組HIF－1α表達(dá)下調(diào)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表1)。

2.4 血管百分比與VEGF和HIF－1α表達(dá)相關(guān)性

Western blotting結(jié)果顯示(見圖3)，血管百分比與 VEGF(r=0.693，P ＜0.01)和 HIF －1α(r=0.785，P＜0.01)表達(dá)呈正相關(guān)，因此VEGF和HIF－1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.641，P ＜0.05)。

2.5 中藥川貝改善過敏性氣道炎癥

組織學(xué)分析顯示，模型組呈典型哮喘病理特征(見圖5A)。許多炎細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管周圍，支氣管上皮增厚，與PBS組比較炎癥指標(biāo)明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見表1)。給予中藥川貝干預(yù)后，氣道炎癥明顯改善，炎細(xì)胞減少，支氣管上皮增厚范圍縮小(見圖5B)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)(見表1)。

圖5 小鼠肺組織組織病理學(xué)切片(200×)

3 討論

為闡明中藥川貝抗血管形成機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了平均炎細(xì)胞指數(shù)和血管百分比。哮喘模型小鼠肺組織可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管周圍，同時(shí)支氣管上皮細(xì)胞損傷，炎癥是哮喘加重的一個(gè)重要因素［5］。炎癥效應(yīng)細(xì)胞(肥大細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等)是血管形成的主要誘因，這與哮喘患者血管生成增多相一致［6－9］，哮喘模型小鼠血管百分比明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥川貝不僅可以改善氣道炎癥，而且可以減少血管生成，結(jié)果證實(shí)中藥川貝具有抗血管生成作用。

本研究證實(shí)了VEGF和HIF－1α表達(dá)的關(guān)系。VEGF的激活受HIF－1α調(diào)控，哮喘發(fā)作時(shí)HIF－1α表達(dá)增加，從而使VEGF表達(dá)上調(diào)，最終引起血管生成增加，這與文獻(xiàn)結(jié)果相一致。

在哮喘模型小鼠上還發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞，肺泡內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，此結(jié)果明確了VEGF表達(dá)和血管百分比之間的關(guān)系。眾所周知，在血管生成過程中，VEGF起核心作用［10］。中藥川貝降低VEGF表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，最終降低血管百分比，VEGF表達(dá)降低可能是中藥川貝抗血管生成的機(jī)制之一。

綜上所述，中藥川貝可以減輕氣道炎癥，降低VEGF和HIF－1α表達(dá)，從而抑制哮喘模型小鼠肺組織血管生成，本研究證實(shí)中藥川貝具有較好的治療哮喘的作用。

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