吳勃巖，王雪，董靜，劉文波，孫陽，郭艷瑩，王曉軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切，是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的重要途徑。齊墩果酸(Olesnolic Acid，簡稱OA)是一種天然產(chǎn)物化學(xué)成分，廣泛存在于女貞子、白花蛇舌草、夏枯草、烏梅、三七、山茱萸、山楂、丁香、連翹等植物中。齊墩果酸具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫雙向調(diào)解、抑瘤、促凋亡等多種藥理作用［1－3］。本文研究齊墩果酸對(duì)肉瘤S180荷瘤小鼠線粒體凋亡途徑中相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C和Caspase－3表達(dá)的影響，探討其抗腫瘤作用機(jī)制，為齊墩果酸用于臨床治療腫瘤奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，6～8周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物、瘤株和試劑

齊墩果酸(Sigma公司);小鼠S180腹水瘤株(購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院);細(xì)胞色素C和Caspase－3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)制腫瘤動(dòng)物模型

在無菌的條件下取傳代后7天生長良好的S180腹水瘤株，用無菌生理鹽水按1∶3稀釋，以0.2ml/只接種于小鼠右側(cè)腋下，待其長為實(shí)體瘤，陽性率為100%。

2.2 檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3蛋白含量

將接種S180腫瘤細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為模型組，齊墩果酸高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺組。于接種瘤細(xì)胞6h后首次給藥，齊墩果酸高、中、低劑量組分別按4.992mg/kg、2.496mg/kg、1.248mg/kg 灌胃給藥，環(huán)磷酰胺(CY)組40mg/kg腹腔注射，腫瘤模型組以生理鹽水0.2ml/只灌胃，連續(xù)給藥8天，每日1次。斷髓處死小鼠，剝離瘤組織，10%甲醛固定，選用免疫組化法常規(guī)制片，檢測(cè)細(xì)胞色素C和Caspase－3蛋白含量(按試劑盒說明書步驟操作)。利用Motic Images Advanced 3.2分析軟件對(duì)各組腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3蛋白陽性細(xì)胞平均光密度值進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，以SPSS 17.0軟件處理，采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

齊墩果酸能上調(diào)S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase－3蛋白的表達(dá)。經(jīng)免疫組化法染色后觀察腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3的表達(dá)，陽性反應(yīng)均定位于胞膜和胞漿內(nèi)(棕黃色或棕褐色顆粒)。通過10×40高倍鏡下觀察標(biāo)本，每張切片隨機(jī)選取五個(gè)視野，選取視野內(nèi)的所有陽性顆粒，并利用分析軟件對(duì)各腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3陽性細(xì)胞平均光密度值進(jìn)行分析。與模型組比較，給藥組的細(xì)胞色素C平均光密度值有所升高，齊墩果酸高劑量組和齊墩果酸中劑量組與模型組比較差異極顯著(P＜0.01);低劑量組與模型組比較存在顯著差異(P＜0.05)。與模型組比較，給藥組的Caspase－3平均光密度值均有所升高，齊墩果酸高、中、低三個(gè)劑量組與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3表達(dá)的影響(s)

表1 齊墩果酸對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤組織中細(xì)胞色素C和Caspase－3表達(dá)的影響(s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

10 0.1495 ±0.02048 0.1188 ±0.01246 CY組 40 10 0.2181 ±0.01831＊＊ 0.2384±0.01133＊＊OA高劑量組 4.992 10 0.2076±0.00930＊＊ 0.2250±0.01788＊＊OA中劑量組 2.496 10 0.1727±0.01385＊＊ 0.1862±0.02380＊＊OA 低劑量組 1.248 10 0.1659 ±0.01267* 0.1572 ±0.02180平均光密度值細(xì)胞色素C Cspase－3模型組 —組別 給藥量(mg/kg)n＊＊

4 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除突變和受損細(xì)胞的主要機(jī)制，凋亡過程的啟動(dòng)與實(shí)施受多種分子的調(diào)控，這些關(guān)鍵分子的異常表達(dá)和功能改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過控制凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白或酶類的表達(dá)或功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，已成為腫瘤治療中頗具吸引力的分子靶點(diǎn)。抑癌基因p53能激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，p53 通過下調(diào) Bcl－2 蛋白［4－5］，上調(diào)Bax蛋白而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;p53也可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素C及Caspase蛋白的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡的主要路徑是由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路，線粒體不僅是為真核細(xì)胞代謝提供能量的工廠，還是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控中心。細(xì)胞色素C在細(xì)胞凋亡中起開關(guān)作用，是線粒體電子傳遞鏈中的一員。線粒體在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)釋放出促凋亡因子如細(xì)胞色素C到細(xì)胞漿中，與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf－1)結(jié)合并激活，繼而引發(fā)Caspase家族的級(jí)聯(lián)激活，切割細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)生細(xì)胞凋亡。

Caspase家族在凋亡程序中起到執(zhí)行者的作用，一旦被激活，細(xì)胞凋亡將不可避免的進(jìn)行下去，上游的Caspase就能順次激活下游的Caspase，形成Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將凋亡信號(hào)一級(jí)級(jí)傳遞至凋亡底物，完成細(xì)胞凋亡過程。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的過程中具有非常重要的作用，是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase－3是細(xì)胞凋亡最為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在各種因素誘導(dǎo)的凋亡程序中起最后的樞紐作用，是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶。Caspase還能夠降解細(xì)胞凋亡抑制因子，如Bcl－2等。Caspase水解Bcl－2家族，在除去抗凋亡因子的同時(shí)還可以激活促凋亡因子，加速凋亡的進(jìn)程，因此Caspase家族在細(xì)胞凋亡中處于中心地位。免疫組化結(jié)果提示，齊墩果酸能促進(jìn)S180荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase－3蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的作用，其機(jī)制可能與線粒體通路有關(guān)。

［1］王奇，蘆柏震.齊墩果酸的研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2008，19(9):711－712.

［2］吳勃巖.女貞子有效成分齊墩果酸對(duì)S180荷瘤小鼠抑瘤作用及存活時(shí)間的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2010，27(1):37 －38.

［3］董靜，李明珠，吳勃巖.原位末端標(biāo)記法檢測(cè)齊墩果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥信息，2013，30(3):134 －135.

［4］吳勃巖.齊墩果酸對(duì)肉瘤S－180荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(6):34 －35.

［5］吳勃巖，董靜，高明，等.齊墩果酸對(duì)S180荷瘤小鼠P53蛋白表達(dá)及 TNF－α 的影響［J］.國際遺傳學(xué)雜志，2010，33(4):63－64.