任瑞芳， 黃良國(guó)， 黃名璐， 蔣國(guó)紅， 白 潔

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymaI stem cells，MSCs)是骨髓細(xì)胞中的粘附細(xì)胞部分，也稱為塑料粘附細(xì)胞，在骨髓中參與構(gòu)成造血干細(xì)胞的生存和分化的微環(huán)境，且特定條件或微環(huán)境下可以分化為神經(jīng)細(xì)胞［1］、心肌細(xì)胞［2］、和肌腱［3］等多種細(xì)胞。其特點(diǎn)有:(1)取材方便易于分離培養(yǎng)，避免了胚胎細(xì)胞的相關(guān)倫理問(wèn)題;(2)具有強(qiáng)大的增殖和自我更新能力可跨胚層分化為多種細(xì)胞，使不可再生細(xì)胞的再生成為可能;(3)處于未分化的原始細(xì)胞狀態(tài)，不存在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，避免了免疫排斥問(wèn)題，還可自由通過(guò)血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)的各個(gè)部位［4，5］。為細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究提供了極大的方便，具有廣闊的研究前景和極大的臨床實(shí)用價(jià)值。成為了目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究最熱門(mén)的焦點(diǎn)細(xì)胞之一。因此摸索一個(gè)簡(jiǎn)單、高純度MSCs體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法極為重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠MSCs，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志以確定其純度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康SD大鼠，雌雄不限，80～150 g(重慶第三軍醫(yī)科大學(xué)提供)。L-DMEM培養(yǎng)液、Hyclone胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)，二甲基亞楓(北京拜爾迪生物公司)，小鼠抗大鼠CD29-FITC、小鼠抗大鼠CD45-PE、小鼠抗大鼠CD90-PE(USBiological公司)，小鼠IgG-PE(BD Bioscierces公司)、IgG-FITC(Biolegend公司)，青霉素鈉、硫酸鏈酶素(華北制藥廠)。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，CO2孵箱(Thermo，美國(guó))，高壓消毒鍋(TOMY，日本)，－20℃冰箱(青島海爾)，－80℃冰箱(Forma Scientic，德國(guó))，離心機(jī)DT5-1(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)，MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)(Forma Scientic，德國(guó))，光學(xué)倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSCs的分離、培養(yǎng)及篩選 取4 w左右健康清潔SD大鼠，脫臼處死后，置75%乙醇浸泡10 min，無(wú)菌情況下剪取雙側(cè)股骨及脛骨，于超凈臺(tái)內(nèi)用PBS緩沖液沖洗數(shù)次，剪去骨周?chē)M織及兩端軟骨，用20 ml注射器抽取L-DMEM單純培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，分離骨髓細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基后接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，至37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h半換液、48 h全換液，逐漸去除未貼壁的懸浮細(xì)胞和死細(xì)胞，以后每2 d全換液1次，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)至7～8 d后培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞融合至80% ～90%時(shí)進(jìn)行傳代，用PBS液緩慢沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶1～2 ml，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞開(kāi)始收縮、變圓，細(xì)胞間隙逐漸增大時(shí)棄去胰酶，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復(fù)沖吹瓶壁，使細(xì)胞脫落，制成單細(xì)胞懸液。視細(xì)胞量按1∶2或1∶3傳代，此時(shí)記為P1(第1代)，以后每3 d左右傳代1次。

1.3.2 MSCs 的鑒定 通過(guò)流式術(shù)對(duì)大鼠MSCs表面標(biāo)記物(CD29、CD45、CD90)進(jìn)行檢測(cè):取細(xì)胞P1～10的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用 PBS洗滌2次，加入0.25%胰酶消化、離心(1000 r/min，5 min)收集細(xì)胞后，PBS重懸細(xì)胞，再次離心(1000 r/min，5 min)，棄上清，用 200 μl PBS液制成 5×105個(gè)MSCs的細(xì)胞懸液。分別將其分為3組，第1組加入大鼠IgG-FITC、IgG-PE各5 μl作對(duì)照，第2組加入大鼠 CD29-FITC、CD45-PE 各 5 μl，第 3 組加入CD90-PE 5 μl，混勻后室溫避光 25 min，每管加入PBS液 2 ml，振蕩器混勻后離心(1000 r/min，5 min)，棄上清，加入2%多聚甲醛200 μl固定，待上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察MSCs

L-DMEM培養(yǎng)液中的全骨髓細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)均一密集的橢圓形細(xì)胞，折光性強(qiáng)。24 h半換液后可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，3 d全換液有部分細(xì)胞貼壁，倒去未貼壁的漂浮細(xì)胞后，可見(jiàn)有部分細(xì)胞由橢圓形變?yōu)槎嘟切巍⒍贪艋蚨趟笮蔚刃螒B(tài)。4～6 d時(shí)，細(xì)胞折光性更強(qiáng)，并不斷分裂增殖，細(xì)胞由短梭形、多角形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，并逐漸擴(kuò)散、相互交聯(lián)，成集落樣分布。7～8 d時(shí)，細(xì)胞均為長(zhǎng)梭形。細(xì)胞傳代后鏡下可見(jiàn)形態(tài)呈一致的長(zhǎng)梭狀，且分布均勻。細(xì)胞的增殖速度較原代明顯增快，3 d左右即可融合達(dá)80% ～90%(見(jiàn)圖1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠MSCs表型，結(jié)果顯示P3～6細(xì)胞CD29、CD90陽(yáng)性率均大于90%，CD45陽(yáng)性率均小于10%。細(xì)胞在P1～2時(shí)純度逐漸升高。在P7～10時(shí)純度逐漸降低(見(jiàn)圖2)。

3 討論

MSCs是來(lái)源于中胚層的除非造血干細(xì)胞以外的一類(lèi)干細(xì)胞，20世紀(jì)70年代Friedenstein等首次從骨髓中分離出MSCs，雖然其在骨髓內(nèi)含量較低，它取材方便，容易分離、獲得及培養(yǎng)，具有高度增殖及自我更新能力，且免疫原性低，另外MSCs易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，不論質(zhì)粒還是病毒均可攜帶目的基因轉(zhuǎn)染 MSCs，而其功能不受影響［6，7］，可作為細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的有效載體。隨著研究的深入及技術(shù)的改進(jìn)，目前獲得MSCs的常見(jiàn)方法主要有以下幾種［8，9］:密度梯度離心法(Percoll)、貼壁篩選法、免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法。這些方法中，密度梯度離心法由于反復(fù)離心，可能致使骨髓微環(huán)境中對(duì)MSCs生長(zhǎng)有利的細(xì)胞因子和促貼附物質(zhì)丟失，而不利于細(xì)胞的體外擴(kuò)增;而流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠法實(shí)驗(yàn)成本昂貴，骨髓需要量大，對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，甚至導(dǎo)致完全失活，且難以獲得大量高純度的MSCs。因此，本實(shí)驗(yàn)采用貼壁篩選法，根據(jù)MSCs在塑料組織培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)，而白細(xì)胞和造血干細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)對(duì)其進(jìn)行逐步分離。MSCs在骨髓中密度很低，且隨動(dòng)物年齡增長(zhǎng)而減少，故本實(shí)驗(yàn)選用幼年大鼠骨髓在L-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)歷潛伏期、指數(shù)增生期和停滯期。原代細(xì)胞24 h即可貼壁，培養(yǎng)4～6 d呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，7 d達(dá)平臺(tái)期。此方法獲得的細(xì)胞生長(zhǎng)良好且增殖快。

MSCs是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群，未發(fā)現(xiàn)特異性表型抗原;為了便于分析相關(guān)研究結(jié)果，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)統(tǒng)一了MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，確定其表面抗原特征為［10］:CD73、CD90、CD105 CD29、CD106、CD146、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、骨特異性堿性磷酸酶(STRO-3)等表達(dá)陽(yáng)性，而CD45、CD34、CD79α或CD19以及 HLA 2DR陰性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CD29、CD45和CD90來(lái)鑒定P1～10的MSCs，結(jié)果顯示;P3～6大部分細(xì)胞表達(dá)CD29和CD90，極少量細(xì)胞表達(dá)CD45，提示所培養(yǎng)細(xì)胞為高純度MSCs，適于做組織工程的種子細(xì)胞。

分離培養(yǎng)MSCs的方法中貼壁篩選法具有操作簡(jiǎn)單、便捷，對(duì)細(xì)胞活性影響小等優(yōu)點(diǎn)，有利于MSCs的貼壁、增殖和篩選，且體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定，篩選的MSCs純度很高。

圖1 A:原代細(xì)胞5 d;B:第4代MSCs(×100)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第4代MSCs示:大部分細(xì)胞表達(dá)CD29和CD90，極少量細(xì)胞表達(dá)CD45

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