許沛冬，趙 艷，張曉波，李新英

(1.海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228； 3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 集寧 012000)

草地早熟禾根際固氮菌的培養(yǎng)

許沛冬1,2，趙 艷2，張曉波1,2，李新英3

(1.海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228； 3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 集寧 012000)

從草地早熟禾(Poapratensis)根際土壤中篩選得到8 株具有較高固氮、溶磷能力的高效固氮菌菌株，研究其培養(yǎng)條件及典型生長曲線。結(jié)果表明，本研究篩選得到的菌株對溫度的適應(yīng)范圍比較廣，在20～40 ℃的環(huán)境條件下可以正常完成新陳代謝及繁殖發(fā)育，最適生長溫度為25 ℃；菌株在中性或偏堿性的條件下生長較好，最適生長初始pH值為7.0～7.5；菌株N4、N5、N10、N16、N17、N20的最佳通氣量為220 mL，菌株N2、N14的最佳通氣量分別為200及100 mL。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，進一步試驗，得到了固氮菌菌株的典型生長曲線，絕大部分的菌株在培養(yǎng)2 h后就進入了對數(shù)生長期，不同的菌株進入延時期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的時間及持續(xù)時間也不同。

草地早熟禾；固氮菌；培養(yǎng)條件；典型生長曲線

草地早熟禾(Poapratensis)是我國草坪建植的主要冷季型草坪草之一，被廣泛應(yīng)用在我國北方地區(qū)，它喜愛溫暖潮濕的環(huán)境，且抗寒性強，溫度域較寬[1]。植物根際微生物的數(shù)量變化以及群落結(jié)構(gòu)的變化與植物的生長發(fā)育有著密切的聯(lián)系，一方面可以影響到植物對水分及養(yǎng)分的吸收，另一方面也影響著植物對不良環(huán)境的抵抗能力[2-3]。而其中禾本科植物根際固氮菌更是對其宿主植物的生長具有直接提供氮素、產(chǎn)生植物激素等促進作用[4-5]，得到了人們的廣泛關(guān)注與研究。為了獲得高效的菌株以促進生物菌肥的研制，植物根際固氮菌生長環(huán)境以及培養(yǎng)條件的研究[6-7]也隨之展開，其中重點集中在溫度、光照、pH值、需氧量等方面。

一般而言，影響微生物生長的環(huán)境條件主要包括物理及化學(xué)兩個方面的因素[8]，其中，溫度、pH和氧氣是影響微生物體內(nèi)多種生物化學(xué)反應(yīng)及細胞生命活動最重要的因素。對根際促生菌(PGPR)而言，適宜的溫度有利于提高其生物活性，同時在最適宜的溫度條件下，菌株細胞可以最大限度地產(chǎn)生所需要的代謝產(chǎn)物[8]；而pH與微生物的生命活動有著密切聯(lián)系，不僅能直接影響細菌細胞的生命活動，還可以通過微生物主導(dǎo)的硝化作用降低重金屬對根系的毒害，同時對于固氮菌來說，通過pH的調(diào)節(jié)可以使其表達出較高的固氮酶活性[9-11]；環(huán)境中氧氣是否存在或者存在量的多少都會直接影響到微生物的生長過程，在某些情況下，有些微生物的代謝方式會因生長環(huán)境中氧氣濃度的變化而變化，進而直接影響到微生物的生長速率[8]。

本研究分析溫度、pH、通氣量對草地早熟禾根際土壤中經(jīng)過分離純化、效能測定篩選出的8株固氮菌株的影響，并根據(jù)上述研究結(jié)果測定固氮菌株的典型生長曲線，進而為禾本科植物根際促生菌最適生長條件的研究以及菌株擴大繁殖、生物菌肥的研制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株從山西晉中地區(qū)生長3年的健康純草地早熟禾的根際土壤中分離純化而來，經(jīng)生物效能測定得到具有較高固氮、溶磷、分泌生長素的固氮菌共8株，分別編號為N2、N4、N5、N10、N14、N16、N17、N20。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要儀器

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)[12-13]：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 8.0 g，Agar 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

主要儀器：HZO-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，LDZX-75KB高壓蒸汽滅菌鍋，721型分光光度計，便攜式CP-401型pH計。

1.2 試驗方法

采用比濁法測定不同條件對各供試菌株生長的影響，并設(shè)立空白對照[14-16]。

1.2.1 溫度條件對菌株生長的影響測定 將固氮菌菌株按2%的接種量，接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，每個菌種接種4支試管，分別標(biāo)記為10、15、20、25、30、35、40、45 ℃；按照標(biāo)記溫度，在振蕩培養(yǎng)箱中在轉(zhuǎn)速180 r·min-1下，培養(yǎng)48 h后測定每管菌株的OD600吸光值。

1.2.2 初始pH值對菌株生長的影響測定 用1 mol·L-1的NaOH和1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)裝有LB液體培養(yǎng)基試管內(nèi)的pH值，標(biāo)記pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，將固氮菌菌株按2%的接種量，接種至上述液體試管培養(yǎng)基，每個菌種接種4支試管，按照標(biāo)記pH，在振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃轉(zhuǎn)速180 r·min-1下，培養(yǎng)48 h后測定每管菌株的OD600吸光值。

1.2.3 通氣條件對菌株生長的影響測定 將固氮菌株按5%的接種量，接種至LB液體培養(yǎng)基5個不同裝液量的250 mL三角瓶中，分別為30 mL裝液量(設(shè)定通氣量為220 mL)、50 mL裝液量(設(shè)定通氣量為200 mL)、100 mL裝液量(設(shè)定通氣量為150 mL)、150 mL裝液量(設(shè)定通氣量為100 mL)、180 mL裝液量(設(shè)定通氣量為70 mL)，在振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃轉(zhuǎn)速180 r·min-1下，培養(yǎng)48 h后測定每管菌株的OD600吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel整理，采用DPS(7.05)統(tǒng)計軟件分析，用Tukey法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度條件對菌株生長的影響

從草地早熟禾根際所篩選的固氮菌株在10～45℃的溫度范圍內(nèi)都能夠正常生長(圖1)，可見本研究所篩選得到的菌株對溫度的適應(yīng)范圍較廣，屬寬溫微生物。大部分菌株在20～30 ℃時OD600吸光值最高，其中菌株N2、N14、N20在30 ℃時OD600吸光值最高；菌株N4、N17在20 ℃時OD600吸光值最高；菌株N5、N10及N16在25 ℃時OD600吸光值最高，即分別為對應(yīng)這些菌株的最適生長溫度。根據(jù)方差分析，所測8株菌株最適溫度差異不顯著(P>0.05)，即20～30 ℃菌株生長狀況均良好。

圖1 溫度條件對固氮菌株生長的影響

2.2 初始pH值對菌株生長的影響

固氮菌株可以在pH 4.0～9.0生長，但根據(jù)菌液的OD600吸光值，8株固氮菌株最適生長pH值為7.0～7.5(圖2)，且差異不顯著。具體來說，菌株N2、N4、N14、N16最適pH值為7.0，菌株N5、N10、N17、N20最適pH值為7.5。據(jù)方差分析，8株固氮菌菌株最適初始pH值差異不顯著，即所測8株固氮菌株在中性或偏堿性的條件下生長良好。

圖2 pH條件對固氮菌株生長的影響

2.3 通氣條件對菌株生長的影響

菌株N4、N5、N10、N16、N17、N20通氣量為220 mL時生長最好，越高的氧分壓對于這6株菌株的生長越有利；菌株N2在通氣量200 mL時最適宜其生長，在通氣量為220 mL時生長受到一定的阻礙；而菌株N14則在通氣量為100 mL時生長最好(圖3)。據(jù)方差分析，N4、N17與N20在通氣條件下生長差異顯著(P<0.05)，而與其他菌株相比差異不顯著(P>0.05)。

2.4 典型生長曲線

菌株N2、N4在2～16 h曲線明顯上升到達對數(shù)生長期，菌體經(jīng)過16～20 h的大量繁殖后逐漸進入穩(wěn)定期，多數(shù)菌株生長曲線在20 h后明顯下降，說明菌株開始進入衰亡期(圖4)；菌株N5、N10延遲期為0～4 h后，4～14 h進入對數(shù)生長期，14～18 h為穩(wěn)定期，18 h之后進入衰亡期；菌株N14、N16于2～12 h時進入對數(shù)期，其中菌株N14的穩(wěn)定期為12～14 h，14 h 后進入衰亡期，菌株N16穩(wěn)定期為12～18 h，18 h后進入衰亡期；菌株N17于2～14 h進入對數(shù)期，在14～20 h穩(wěn)定期后，20 h進入衰亡期；菌株N20在2～10 h為對數(shù)生長期，穩(wěn)定期為10～16 h，16 h以后為衰亡期。

圖3 通氣條件對固氮菌株生長的影響

圖4 固氮菌株典型生長曲線

3 討論與結(jié)論

3.1 溫度條件對菌株生長的影響

任何微生物僅能在一定的溫度范圍內(nèi)生存，并在適宜溫度下大量繁殖，過低的溫度會使原生質(zhì)膜處于凝固狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)運輸受阻，質(zhì)子梯度難以形成，最終微生物的生長也將停止；而伴隨著溫度升高，微生物細胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)和酶促反應(yīng)加快，生長速度隨之提高[17-19]；然而，當(dāng)溫度升高至某一界限時，微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸或其他細胞成分將會發(fā)生不可逆的變性作用，甚至導(dǎo)致微生物細胞死亡[20]。即微生物與其他生物一樣，生長溫度有著一定的范圍且存在著最適生長溫度。湯春梅等[21]在研究中測定了燕麥(Avenasativa)和小麥(Triticumaestivun)根際所分離得到的9株促生菌對溫度條件的需求與適應(yīng)能力，結(jié)果表明，9株促生菌適應(yīng)范圍很廣，在5～45 ℃條件下即可正常生長，但不同菌株最適培養(yǎng)溫度條件卻不盡相同；黃菊芳等[22]探討了培養(yǎng)溫度對深海熱液噴口周圍微生物生長繁殖的影響，得出33 ℃為菌株的最適生長溫度。與前人的研究相比，本研究供試菌株在20～40 ℃的環(huán)境條件下即可正常完成新陳代謝以及繁殖發(fā)育，大部分的固氮菌株在25 ℃左右達到生長峰值，培養(yǎng)所需溫度更接近常溫，所以，如果在工業(yè)生產(chǎn)中，固氮菌發(fā)酵生產(chǎn)不需要設(shè)置特殊的溫度來進行，從而可以降低一定的生產(chǎn)成本。

3.2 初始pH值對菌株生長的影響

在微生物培養(yǎng)過程中不適合的初始pH值會在發(fā)酵生產(chǎn)的初期就表現(xiàn)出對微生物自身的不利影響，主要是由于氫離子的濃度與營養(yǎng)物質(zhì)進入微生物細胞體內(nèi)以及不適合的pH值打破了培養(yǎng)基中離子的化學(xué)平衡，降低了培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的濃度[23]。因此，研究尋找有益特定微生物的發(fā)酵最適初始pH值，并有效應(yīng)用在工業(yè)培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)中，成為相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)中的一項重要措施。李鳳霞等[24]分離自燕麥根際的9株P(guān)GPR菌株在pH值為7.0時都有很高的固氮酶活性，大部分都超過80 nmol·mL-1·h-1。與其研究結(jié)果類似，本研究固氮菌株的最適生長初始pH值為7.0～7.5，表明篩選到的8個功能菌株在中性或稍偏堿性的條件下培養(yǎng)即可達到其生長峰值。所以，對在工業(yè)發(fā)酵中設(shè)置中性或稍偏堿性的pH更加有益于固氮菌的生長。

3.3 通氣條件對菌株生長的影響

幾乎所有的植物在其生長過程中都離不開氧氣，但對微生物來說，對氧氣的需要和耐受能力因類群的不同差別很大，一般根據(jù)微生物需氧的不同分為專性好氧微生物、兼性厭氧微生物、微好氧微生物以及專性厭氧微生物。通氣量可以有效提高菌體培養(yǎng)的生物量，發(fā)酵過程需高通氧，即固氮菌B8-G菌株可能為專性好氧微生物[25]；草地早熟禾根際膠質(zhì)芽孢桿菌的菌株最佳通氣量具有一定的差異[16]。在本研究中，各菌株最適通氣量的測定結(jié)果與前人的研究[16，25]相似，所篩選的菌株最佳通氣量并不相同，其中有50%屬于專性好氧菌(N4、N5、N10、N16、N17、N20)，N2在通氣量為150～200 mL時生長最好，為兼性厭氧菌，菌株N14通氣量為100 mL時生長最好，為微好氧菌。故而，在培養(yǎng)過程中要對菌株的需氧量進行測定，以保證菌株的正常生長發(fā)育。

3.4 典型生長曲線

本研究把供試菌株接種到液體培養(yǎng)基后，在適宜的溫度、pH值、通氣條件下，以這些菌株細胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，得到了不同菌株的典型生長曲線。根據(jù)生成的典型生長曲線可以看出，本研究篩選到的各菌株在生長時都具有比較明顯的延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期。在國內(nèi)外對菌株生長曲線的測定研究已經(jīng)有過一定的報道，如對放線菌[26]、酵母菌[27]的生長曲線均進行了研究。在本研究中，不同菌株的典型生長曲線并不相同，絕大部分的菌株在培養(yǎng)2 h后就進入了對數(shù)生長期，但它們的對數(shù)生長持續(xù)時間又有所不同，例如菌株N2、N4在2～16 h后就到達對數(shù)生長期，而菌株N14、N16經(jīng)過延遲期后，于2～12 h時進入對數(shù)期；此外，不同的菌株除了對數(shù)期持續(xù)時間有所不同外，達到穩(wěn)定期以及最后進入衰亡期的時間及持續(xù)時間也不同。這些數(shù)據(jù)將對菌株的未來生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

Culture condition of nitrogen fixation strains isolated from rhizosphere of Kentucky bluegrass

XU Pei-dong1,2, ZHAO Yan2, ZHANG Xiao-bo1,2, LI Xin-ying3

(1.Key Laboratory of Protectionand Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources (Hainan University), Ministry of Education, Haikou 570228, China；2.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China；3.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Inner Mongolia Ulanqab, Jining 012000, China)

Culture conditions and typical growth curve of eight nitrogen-fixing bacteria strains with strong ability of nitrogenase activity and the solubilizing phosphorus capability isolated from Kentucky bluegrass rhizosphere soil samples were studied. The results showed that the temperature adaptation scope of strains was wide and strains could grow well between 20～40 ℃, with the optimum growth temperature of 25 ℃. The nitrogen fixation strains could grow well in a neutral or slightly alkaline pH condition, with the optimum initial pH range of 7.0 to 7.5. The optimum ventilation volume of strain N4, N5, N10, N16, N17and N20were 220 mL, and the optimum ventilation volume of strain N2and N14were 200 and 100 mL. Based on the above results, the typical nitrogen-fixing bacteria strains growth curves were determined. Most of the strains entered the logarithmic phase after 2 h. Different strains started the lag phase, the logarithmic phase, the stationary phase and the declining phase at different culture time.

Kentucky bluegrass; nitrogen fixation strains; culture condition; typical growth curve

ZHANG Xiao-bo E-mail：angiaoo@126.com

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0417

2013-07-29 接受日期：2013-09-03

海南省自然科學(xué)基金(312060)

許沛冬(1990-)，男，內(nèi)蒙古集寧人，在讀碩士生，主要從事草坪管理相關(guān)研究。E-mail：xuridongshengxpd@163.com

張曉波(1978-)，男，山西岢嵐人，副教授，碩導(dǎo)，博士，主要從事草坪管理相關(guān)研究。E-mail：angiaoo@126.com

S543.08;S435.4

A

1001-0629(2014)06-1033-06*1