潘銀平，閆 珍，潘 磊，陳培豐△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053；2.杭州市第二人民醫(yī)院，浙江杭州310015；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006）

惡性腫瘤最顯著的表型是腫瘤細(xì)胞的失控性生長及異常血管增生。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療主要是針對惡性腫瘤細(xì)胞的殺傷和控制，但要達到臨床治愈較困難。通過抑制腫瘤血管形成治愈腫瘤已成為可能[1]。目前抑制腫瘤血管生成已為探討中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的作用機制提供了一個新思路[2]，深入開展相關(guān)研究對豐富中醫(yī)藥抗腫瘤理論，提高臨床療效，促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化是一項有益的探索。清熱消積方是浙江省中醫(yī)院腫瘤科在長期的臨床實踐中逐漸積累的抗癌有效方劑，具有一定的臨床療效[3]。本實驗采用荷瘤Lewis 肺癌小鼠建立移植瘤模型觀察清熱消積方對腫瘤組織中缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1α（HIF-1α）蛋白表達的影響，探討該復(fù)方抑制腫瘤血管生成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株

近交系C57BL/6J 純系小鼠，上海斯萊克動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0003。在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。Lewis 肺癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 實驗用藥

清熱消積方中蛇六谷、白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍、貓爪草、貓人參等采購自浙江省中醫(yī)院中藥房。設(shè)定中藥中劑量組作為臨床常用劑量，給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算公式[4]方法計算：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3。式中：dB、dA 是AB 2 種動物的每kg 體質(zhì)量劑量（mg/kg）；RB、RA 是動物體型系數(shù)，小鼠為59，人為100；WA、WB 是動物的體質(zhì)量（kg）值。將該復(fù)方水煎、濃縮，制成高、低、中3 個劑量組（生藥量分別為1.12 g/mL，0.56 g/mL、0.28 g/mL）。環(huán)磷酰胺注射液（cyclophosphamide，0.2 g/支），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字：H32020857；批號：12021725。

1.3 主要試劑與儀器

兔免疫組化試劑盒（美國Invitrogen 公司）；BCA蛋白定量試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液（普利萊基因技術(shù)有限公司）；GL-400SD 超聲波細(xì)胞破碎儀（南京順流儀器有限公司）；ELX8000 全自動酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤小鼠造模、分組與用藥

在無菌條件下取接種Lewis 肺癌10 d 的C57BL/6J 荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無菌條件下取皮下生長良好、呈魚肉狀的瘤組織，去除壞死部分，剪碎，按瘤重與生理鹽水1∶3 制成勻漿，200 目細(xì)胞篩過濾，得瘤細(xì)胞混懸液。1 500 r/min 離心5 min，加生理鹽水調(diào)至腫瘤細(xì)胞數(shù)約為1×107/mL。無菌條件下，75%酒精消毒小鼠右腋下皮膚，用1 mL 無菌注射器取細(xì)胞懸液0.2 mL（約含2×106個活細(xì)胞），無菌條件下接種于小鼠右腋窩皮下，拔出針頭，用無菌棉球輕壓針眼處片刻，防止細(xì)胞懸液流出。接種瘤細(xì)胞后，送回動物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。

接種24 h 后，用隨機化數(shù)字表法將荷瘤小鼠分為5 組，分別為：荷瘤空白對照組（NS 組）；陽性對照組（CTX 組）；清熱消積方高、中、低劑量組；每組12 只小鼠。灌胃：第二天分組后稱體質(zhì)量，即開始給藥，每日1 次，連續(xù)14 d。荷瘤空白對照組，清熱消積方高、中、低3 個劑量組按0.2 mL/10g 量分別胃飼生理鹽水、中藥水煎液。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺，參照人鼠給藥劑量換算后按30 mg/kg（0.3 mg/10 g）作為一次用藥劑量，每周給藥2 次，實驗期間共給藥4 次。

1.4.2 檢測項目及方法

荷瘤小鼠瘤組織HIF-1α 蛋白表達：免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法。

1.4.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料均以（x±s）描述，2 組間比較采用配對t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立移植瘤模型

C57BL/6J 小鼠接種Lewis 肺癌細(xì)胞懸液7d 后在右腋皮下可觸摸到米粒大小結(jié)節(jié)，連續(xù)觀察12d，實驗小鼠接種部位皮下腫塊無自然消退現(xiàn)象，成瘤率100%，符合實驗要求。

2.2 對荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白表達的影響

經(jīng)免疫組化法測定，清熱消積方高、中、低劑量組、CTX 組均能下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達。

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，清熱消積方高、中、低劑量組、CTX 組腫瘤組織平均光密度（MOD）值與NS 組比較均有差異（P＜0.05）；清熱消積方高、中、低劑量組之間的腫瘤組織MOD 值比較均無差異（P>0.05）；清熱消積方高、中、低劑量組與CTX 組腫瘤組織MOD 值兩兩比較均無差異（P>0.05）（表1）。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達（MOD）（x±s）

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，清熱消積方高、低劑量組、CTX 組腫瘤組織陽性細(xì)胞所占值（A%）與NS 組比較均有差異（P＜0.05）；清熱消積方各劑量組間的瘤組織陽性細(xì)胞所占值（A%）均無差異（P>0.05）（表2）。

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達（A%）（x±s）

經(jīng)免疫印跡法測定，如下圖所示，β-actin 片段大小趨于一致，清晰且無雜帶。各組蛋白均有較強的actin 條帶出現(xiàn)，表明各組樣品的蛋白總濃度相近，且各組actin 條帶的亮度相似。而實驗組中，空白對照組HIF-1α 條帶較各治療組明顯增強，治療組中，CTX 組和中藥高、中劑量組條帶亮度趨于一致，中藥低劑量組條帶亮度較CTX 組增強，見圖1。

圖1 各組荷病小鼠腫瘤組織HIF-1 d 蛋白的表達

3 討論

缺氧是實體腫瘤的重要特征之一[5]。惡性腫瘤通過血管新生和增加糖酵解來不斷適應(yīng)缺氧的微環(huán)境，繼而使腫瘤在缺氧條件下也可不斷生長、浸潤。HIF-1α 是廣泛存在的一種缺氧誘導(dǎo)因子，在正常氧分壓條件下它位于胞漿中，正常的細(xì)胞中不表達，在缺氧的條件下則可以進入到核內(nèi)發(fā)揮作用。所確定的受HIF-1α 調(diào)控的缺氧反應(yīng)基因涉及參與腫瘤細(xì)胞的能量代謝、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥及血管擴張、血管新生等多個方面[6-7]。由此可見，HIF-1α在腫瘤的惡性進展過程中起著關(guān)鍵性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 在肺癌中有過度表達，發(fā)揮著促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和影響細(xì)胞凋亡等作用[8-10]。HIF-1α 在腫瘤中的重要作用是可調(diào)節(jié)VEGF 的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)VEGF 的表達，誘導(dǎo)新生血管形成，導(dǎo)致惡性腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[11-12]。HIF-1α 高表達的惡性腫瘤大多分化差、進展快、血管生成密度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、預(yù)后差。

清熱消積方是浙江省中醫(yī)院腫瘤科常用的抗癌復(fù)方，其中蛇六谷，性寒味辛，具有消腫散結(jié)、解毒止痛的功效；白花蛇舌草，性寒味苦，具有清熱解毒、利濕消腫的功效；半枝蓮，性寒味辛、苦，具有清熱解毒、化瘀利尿的功效；絞股藍，性微寒味甘，具有清熱解毒、止咳消痰、益氣健脾的功效；貓爪草，性微溫味甘、辛，具有化痰散結(jié)、解毒消腫的功效；貓人參，性涼味苦、澀，具有清熱解毒、消腫抗癌的功效。諸藥合用，體現(xiàn)了清熱解毒、化痰消積的治則，共除熱毒痰積，邪去而己自安。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，清熱消積方對S180 癌細(xì)胞生長有抑制作用，抑瘤率達30.72%～40.75%，且與對照組的瘤重比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。還證實清熱消積方對VEGF、bFGF 等重要的腫瘤血管生成因子有降低其表達的作用。還能對Lewis 肺癌的CD44V6 表達具有調(diào)節(jié)作用[14]。并可抑制SPC-A-1人肺癌細(xì)胞和HUVEC 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、趨化和成管能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[15]。

本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法觀察對荷瘤鼠腫瘤組織中HIF-1α 蛋白表達的影響。結(jié)果提示：清熱消積方的不同劑量組均能下調(diào)HIF-1α 蛋白的表達，并與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明清熱消積方下調(diào)腫瘤組織的HIF-1α 蛋白的表達可能是其抗腫瘤血管生成等作用機制之一。

[1] 李濤，孫才興. 腫瘤血管形成的分子調(diào)控機制[J]. 中國腫瘤，2014，23（1）：44-48.

[2] 徐艷秋，史鎖芳. 培土解毒方聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌30 例臨床觀察[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，37（3）：64-66.

[3] 陳培豐，孫維成. 清熱消積方治療胃癌的臨床療效觀察[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2003，6（1）：27-28.

[4] 孫敬方. 動物實驗方法學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：357.

[5] 秦姣，龍漢安. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 與腫瘤關(guān)系的研究進展[J]. 西部醫(yī)學(xué)，2010，22（7）：1323-1325.

[6] 李姍姍，姚登福，董志珍. 肝缺氧誘導(dǎo)因子-1α 與肝癌發(fā)生、發(fā)展及治療研究新進展[J]. 世界華人消化雜志，2010，18（4）：361-367.

[7] 趙航，劉東屏. HIF-1α 與實體性腫瘤發(fā)生及臨床關(guān)系的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（9）：2134-2137.

[8] 連一新，施敏驊. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 和環(huán)氧化物酶-2 在肺癌組織中的表達及其與血管生成的關(guān)系[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，32（5）：690-692.

[9] 劉衡，戴天陽. HIF-1 與肺癌關(guān)系研究新進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（23）：3957-3959.

[10] 徐懷陽，鐘竑，陸善偉，等. HIF-1α 與非小細(xì)胞肺癌增殖、血管生成及預(yù)后的關(guān)系[J]. 臨床肺科雜志，2014，19（1）：73-76.

[11] 冉鳳明，魏萬里，胡紅艷，等. STAT3、p-STAT3、HIF-1α、VEGF 蛋白表達與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（14）：2570-2572.

[12] 李國元，趙久達，王成，等. HIF-1α 和VEGF 在胃癌中的表達及臨床意義[J]. 中國癌癥雜志，2010，20（8）：602-606.

[13] 陳培豐，劉魯明. 清熱消積方抑瘤效應(yīng)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技，2000，7（3）：145-146.

[14] 陳培豐，倪桂寶. 清熱消積方對細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)遞與腫瘤轉(zhuǎn)移的影響[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，30（2）：195-198.

[15] 陳培豐，潘磊，金瑩祺. 清熱消積方對人肺腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移、趨化和成管能力的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（4）：497-501.