劉 彬，符秀瓊，劉慰華，張競(jìng)之，劉少軍，劉世明

芒柄花黃素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞株A375凋亡的影響

劉 彬1，符秀瓊2，劉慰華1，張競(jìng)之1，劉少軍1，劉世明1

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260；2. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

目的 研究芒柄花黃素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 凋亡的影響。方法 以人黑色素瘤細(xì)胞A375為研究對(duì)象，MTT法檢測(cè)不同濃度的芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞活性的影響，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芒柄花黃素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率；用Western blot方法檢測(cè)cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-XL的蛋白表達(dá)水平，從而初步探討其凋亡的機(jī)制。結(jié)果 芒柄花黃素可降低A375細(xì)胞的活力并增加其凋亡率，Western blot 結(jié)果顯示芒柄花素增加了A375中cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少了抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)，并增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)。結(jié)論 芒柄花黃素可抑制A375細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與減小Bcl-XL/ Bax 蛋白表達(dá)比例, 從而啟動(dòng)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。

芒柄花黃素;黑色素瘤;細(xì)胞凋亡

芒柄花黃素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是異黃酮類化合物，存在于黃芪[1]、苦參[2]、雞血藤[3]等多種中藥中。研究表明，芒柄花黃素有一定的抗腫瘤作用，它可通過(guò)Caspase依賴的機(jī)制誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116凋亡[4]，有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用[5]，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯[6]。但其對(duì)黑色素瘤的作用國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。黑色素瘤是惡性程度極高的腫瘤之一，占皮膚腫瘤死亡病例的絕大部分。目前最有效的治療方法是手術(shù)切除腫瘤，由于其惡性度高，對(duì)于黑色素瘤已轉(zhuǎn)移或晚期不宜手術(shù)的患者，臨床上仍缺乏有效化療藥物。本實(shí)驗(yàn)以人黑色素瘤細(xì)胞A375為模型，觀察芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞活性和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 從液氮中取出人黑色素瘤細(xì)胞株A375并復(fù)蘇，用含10%FBS(Gibico)的DMEM培養(yǎng)基(Gibico)在37 ℃ 含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，2 d傳代1次，傳代3次后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物及化學(xué)試劑 芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于成都曼思特公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解。3-4，5-二甲基噻唑-2-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自 Sigma公司，抗體均購(gòu)于CST公司 ，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后更換不同濃度的含芒柄花黃素培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含0.1% DMSO 的培養(yǎng)基。分別在作用24及48 h后加入MTT溶液，37 ℃ 放置4 h，移除孔內(nèi)所有液體后加入DMSO將細(xì)胞中的結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，計(jì)算出存活細(xì)胞的比例。

1.4 流式細(xì)胞式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 加入芒柄花黃素刺激細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞上清，胰酶消化細(xì)胞后按凱基公司的Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 芒柄花黃素作用48 h后去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解5 min，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，12 000 r/min低溫離心10 min，棄沉淀。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入5×Lodding Buffer 95 ℃ 5 min蛋白變性，-80 ℃凍存。取15 μg蛋白樣品上樣，用1×Lodding Buffer補(bǔ)至等體積，然后進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入Bcl-XL(1∶1 000)、Bax (1∶1 000)、cleaved-Caspase-3(1∶11 000)、β-actin(1∶1 000)4 ℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜，0.1%TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫緩慢搖動(dòng)1 h，0.1%TBST洗3次，ECL顯影，膠片曝光。

2 結(jié) 果

2.1 芒柄花黃素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375活性的影響 經(jīng)MTT法檢測(cè)，芒柄花黃素在大于25 μmol/L時(shí)A375細(xì)胞的活性較對(duì)照組明顯降低，并呈時(shí)間依賴性(圖1)。雖然25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L藥物濃度均可顯著降低A375細(xì)胞活性(P均<0.05)，但在25 μmol/L時(shí)藥物對(duì)細(xì)胞活性的抑制效果與50 μmol/L、100 μmol/L比較沒(méi)有顯著性差異，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用藥物的最高濃度為25 μmol/L。

圖1 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞活力的影響

2.2 芒柄花黃素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡的影響 用流式細(xì)胞學(xué)方法對(duì)Annexin V / PI 雙染的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，芒柄花黃素可增加A375細(xì)胞的凋亡，25 μmol/L濃度時(shí)最明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響

2.3 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-XL及Bax表達(dá)影響 不同濃度的芒柄花黃素刺激A375細(xì)胞48 h后，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，cleaved Caspase-3表達(dá)增加，且芒柄花黃素增加A375細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)，并下調(diào)Bcl-XL蛋白，從而明顯降低Bcl-XL/Bax的比例。見(jiàn)圖3～5。

圖3 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞中cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

芒柄花黃素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是一種異黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用。既往研究表明，芒柄花黃素可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞凋亡[4，6]，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞周期阻滯[5，7]，增加對(duì)表阿霉素耐藥的子宮癌細(xì)胞凋亡[8]。然而不同腫瘤的病理機(jī)制不盡相同，芒柄花黃素的抗腫瘤效果及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素對(duì)惡性度較高的人黑色素瘤細(xì)胞A375的細(xì)胞活性有抑制作用，并顯著增加細(xì)胞凋亡率，因而筆者從細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白方面著手，并初步探討其抗人黑色素瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。

圖5 芒柄花黃素對(duì)A375細(xì)胞中Bcl-XL蛋白表達(dá)水平的影響

Bcl-2 蛋白家族由抗凋亡蛋白 Bcl-2 和Bcl-XL, 以及促凋亡蛋白Bax, Bid, Bak等組成，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路[9]。Bcl-2 蛋白家族所介導(dǎo)的細(xì)胞活力或凋亡的調(diào)控，是通過(guò)改變促凋亡和抗凋亡蛋白的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，而不是取決于單個(gè)蛋白的表達(dá)水平[10]。研究表明芒柄花黃素可增加表阿霉素對(duì)子宮癌(Hela)細(xì)胞的毒性，其機(jī)制為增加ROS調(diào)節(jié)的抗多重耐藥及提高Bax/ Bcl-2比例，激活Caspase-9和Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。細(xì)胞凋亡中存在著不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Caspase-3是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，同時(shí)也參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控[11]。本研究結(jié)果顯示，芒柄花黃素可明顯增加Caspase-3的剪切體(cleaved Caspase-3, 17 kD)的表達(dá)，激活了Caspase-3，并增加Bax蛋白水平的表達(dá)和抑制Bcl-XL蛋白的表達(dá)，從而降低了Bcl-XL/Bax蛋白表達(dá)水平的比例。促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-XL都屬于Bcl-2的家族成員，都參與了引起細(xì)胞凋亡的線粒體通路調(diào)節(jié)，Bc-l XL/Bax蛋白水平的比例降低會(huì)促使細(xì)胞往凋亡方向發(fā)展[12]。因此，筆者認(rèn)為芒柄花黃素可通過(guò)減小Bcl-XL/Bax 蛋白表達(dá)的比例, 從而啟動(dòng)Caspase-3途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。下一步筆者將對(duì)芒柄花黃素所引起的這些蛋白表達(dá)改變的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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Influence of formononetin on apoptosis in A375 Human melanoma cells

Liu Bin1, Fu Xiuqiong2, Liu Weihua1, Zhang Jingzhi1, Liu Shaojun1, Liu Shiming1

(1. Cardiovascular Disease Institute of The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong, China; 2.TCM College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong China)

Objective It is to observe the influence of formononetin on apoptosis in A375 human melanoma cells.Methods A375 human melanoma cells were used to be the cell model. The influence of formononetin on activity of A375 cells was measured by MTT assay, and the rate of cells viability and apoptosis in A375 cells was, detected by flow cytometry. the protein expression levels of cleaved Caspase-3, Bax and Bcl-XL were detected by Western blot assay in A375 cells with formononetin treatment. Then the mechanism of apoptosis was investigated.Results Cells viability was decreased and apoptosis rate was increased in A375 cells after treatment with formononetin. The Western blot results showed that, formononetin had enhanced the protein expression levels of cleaved Caspase-3 and pro-apoptotic protein Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic protein Bcl-XL. Conclusion Formononetin can reduce cells viability and induce apoptosis in A375 cells. The mechanism is related to reduce the expression of Bcl-XL/Bax protein ratio, thereby start the apoptosis pathway mediated by Caspase-3.

formononetin; melanoma;apoptosis

劉彬，男，博士后，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

劉世明，主任醫(yī)師，E-mail：gzliushiming@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302892)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2013040016226)；中國(guó)博士后基金資助項(xiàng)目(2013M530363)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目(2012C50)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.003

R285.5

A

1008-8849(2014)15-1603-03

2013-11-28