楊 帆, 劉春來, 段立清

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，哈爾濱 150086； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019)

球孢白僵菌SJ-05幾丁質(zhì)酶基因的克隆與序列分析

楊 帆1, 劉春來1, 段立清2*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，哈爾濱 150086； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019)

幾丁質(zhì)酶在昆蟲真菌侵染寄主過程中起著重要的作用。本文對采自內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05進行了幾丁質(zhì)酶的基因分析，從中克隆了幾丁質(zhì)酶Bbchit基因，得到了重組質(zhì)粒pMD19-T/chit。測序結(jié)果表明，Bbchit基因核苷酸序列閱讀框架全長為1047 bp，編碼348個氨基酸，推測分子量為36.924 ku，等電點為5.94。氨基酸序列比對結(jié)果表明，與球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259.1)的氨基酸序列相似性最高，為99.71%。

球孢白僵菌； 幾丁質(zhì)酶基因； 基因克隆； 序列分析

沙棘是我國黃土丘陵區(qū)的水土保持樹種之一，也是當(dāng)?shù)刂饕教坎?，整株植株均含有豐富的營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，具有較高的綜合開發(fā)利用價值。但是，近年來，沙棘木蠹蛾(HolcocerushippophaecolusHua,Chou,FangetChen)時有發(fā)生，為害嚴(yán)重，造成沙棘林大面積死亡。內(nèi)蒙古鄂爾多斯市沙棘木蠹蛾發(fā)生面積大，約1.8萬hm2，平均有蟲株率高達42%[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)白僵菌是沙棘木蠹蛾幼蟲、蛹的主要病原物，是值得開發(fā)利用的病原物之一。

球孢白僵菌[Beauveriabassiana(Balsamo) Vuillemin]是常見的昆蟲病原真菌之一，寄主范圍廣，致病力強，對人、畜、天敵無毒害，不污染環(huán)境，廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。昆蟲病原菌在入侵寄主體壁的過程中會產(chǎn)生相關(guān)的酶類，其中主要是蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及脂酶等水解酶類[2]。當(dāng)這些酶類作用于昆蟲表皮時，協(xié)同運作[3]，可降解由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂類等物質(zhì)組成的昆蟲體壁[4]，使孢子更容易吸附在寄主昆蟲體表上，利于芽管侵入體表，同時也為菌絲的生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)，使菌絲成功侵入昆蟲體腔[5]。這些酶類在球孢白僵菌侵入寄主過程中起重要作用[6]。

幾丁質(zhì)酶由于其有效降解幾丁質(zhì)，在害蟲防治中得到了廣泛的研究，它是由N-乙酰-D-氨基葡糖殘基以β-1,4糖苷鍵連接而成的不分枝鏈狀多糖。幾丁質(zhì)酶存在于昆蟲、線蟲、真菌、一些藻類[7]和酵母中。在昆蟲中，幾丁質(zhì)酶主要作用時間有限，如蛻皮前。幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶，以幾丁質(zhì)為作用底物的水解酶，在以昆蟲體壁為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中和穿透寄主體壁時都能表達[8]。在環(huán)境不太適合期間過度降解幾丁質(zhì)會引起昆蟲生理紊亂，導(dǎo)致昆蟲死亡[9]。在植物體內(nèi)，為增強其防御機制，幾丁質(zhì)酶基因也可以表達。從煙草天蛾中獲得的幾丁質(zhì)酶基因，通過轉(zhuǎn)基因煙草植物表達后，顯著降低了煙草夜蛾幼蟲的生長。為研究害蟲防治，同來自許多生物體的幾丁質(zhì)酶基因被克隆一樣，從致病性真菌中也克隆到了幾丁質(zhì)酶基因[3，10，15，17]。幾丁質(zhì)酶是昆蟲病原真菌的一個重要毒力因子。本研究克隆球孢白僵菌SJ-05幾丁質(zhì)酶基因，并分析該基因編碼的氨基酸序列，為進一步研究幾丁質(zhì)酶在昆蟲體壁水解過程中的重要作用以及構(gòu)建高毒力基因工程菌株提供分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

球孢白僵菌SJ-05分離自內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗沙棘木蠹蛾幼蟲體。

1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小樣快速抽提試劑盒均購自TIANGEN公司，pMDTM19-T Simple vector、rTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ及EcoRⅠ均購自TaKaRa公司，X-gal、氨芐青霉素(Ampr)等購自北京鼎國昌勝生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 SJ-05 DNA的提取

將新鮮PSA斜面培養(yǎng)好的球孢白僵菌SJ-05分生孢子接種于液體培養(yǎng)基中，180r/min，26℃，振蕩培養(yǎng)3d，將菌液轉(zhuǎn)移至50mL無菌離心管中，10000r/min，離心10min，收集菌體，依據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA。

1.4 PCR擴增及目的片段回收

上游引物Bb-chi-F：5′-AAGCTTATGGCTCCTTTTCTTCAAAC-3′，引入了Hind Ⅲ酶切位點；下游引物Bb-chi-R：5′-GAATTCTTACGCAGTCCCCA-AAGTCC-3′，引入了EcoRⅠ酶切位點。引物由上海生工北京合成部合成。

PCR擴增體系20μL：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L上游和下游引物各1μL，0.5U/mL rTaqDNA聚合酶0.3μL，10ng/μL DNA 5 μL，無菌超純水補足至20μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 95℃ 30s； 55℃ 30s； 72℃ 1.5 min， 35個循環(huán)；72 ℃ 10min；4 ℃保存。

檢測PCR產(chǎn)物，回收1100bp左右的目的片段。純化產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 純化產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化

將純化產(chǎn)物與載體在16℃連接過夜(約12 h)后，4 ℃保存。大腸桿菌感受態(tài)細胞采用CaCl2法制備。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，進行藍白斑篩選。

1.6 質(zhì)粒提取及重組質(zhì)粒鑒定

隨機挑取陽性單克隆，加入5 mL LB(含0.1%的Amp)液體培養(yǎng)基，37 ℃下200r/min振蕩培養(yǎng)約12～16h。取3～5 mL菌液，參照質(zhì)粒提取試劑盒方法提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用Hind Ⅲ、EcoRⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD19-T/chit。經(jīng)酶切鑒定成功的陽性克隆樣品送Sangon公司進行DNA序列測定。

1.7 序列及進化分析

用DNAMAN軟件及NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序完成序列分析。用DNA Star分析軟件完成系統(tǒng)進化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌SJ-05幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析

提取球孢白僵菌SJ-05 DNA，進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1100bp左右的特異性PCR條帶，如圖1。將目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，在含有Amp的LB平板培養(yǎng)基上篩選陽性重組子，挑選其中5個陽性克隆，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定重組克隆，結(jié)果表明，5個陽性克隆中均插入了目的片段，大小1100bp左右。

SJ-05幾丁質(zhì)酶基因序列測定結(jié)果表明，該基因含有一個完整的開放閱讀框，閱讀框架全長為1047 bp，幾丁質(zhì)酶基因編碼348個氨基酸殘基，起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。SJ-05幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列及對應(yīng)的氨基酸序列見圖2。

圖1 幾丁質(zhì)酶基因PCR擴增電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis map for PCR product of chitinase gene

2.2 SJ-05幾丁質(zhì)酶基因編碼氨基酸序列分析

利用http:∥www.expasy.org/tools/#translate網(wǎng)站提供的蛋白分析軟件對菌株SJ-05幾丁質(zhì)酶基因編碼氨基酸序列的基本特征進行分析，結(jié)果顯示，該基因預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為36.924 ku，等電點為5.94。氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(Arg、Lys)23個，占6.6%，帶負電荷氨基酸(Asp、Glu)26個，占7.4%，疏水性氨基酸167個，占47.9%，親水性氨基酸118個，占33.7%，見表1。

MotifScan軟件分析該基因編碼的蛋白位點和序列模式表明，其編碼蛋白可能含有1個N-糖基化位點，2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，11個N-端十四烷基化位點，1個蛋白激酶C磷酸化位點，1個幾丁質(zhì)酶-18位點，3個糖基水解酶-18位點，其具體位置如表2和圖3所示。

圖2 SJ-05幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of chitinase gene from SJ-05

表1 幾丁質(zhì)酶的氨基酸含量1)Table 1 Amino acid content of chitinase

1) *疏水氨基酸，# 親水氨基酸。 *Hydrophobic amino acid,# Hydrophilic amino acid.

表2幾丁質(zhì)酶氨基酸序列模塊分析結(jié)果

Table2Motifanalysisoftheaminoacidsequenceofthepredictedchitinase

模塊名稱Name中文名稱Chinesename數(shù)量/個No．位置PositionASN＿GLYC?OSYLATIONN?糖基化位點1334?337CK2＿PHOS?PHO＿SITE酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點2106?109，336?339MYRISTYLN?端十四烷基化位點1152?57，97?102，125?130，165?170，210?215，215?221，258?263，278?283，297?302，317?322，343?348PKC＿PHOS?PHO＿SITE蛋白激酶C磷酸化位點1254?256CHITIN?ASE＿18幾丁質(zhì)酶?18家族1155?163Glyco＿hy?dro＿18糖基水解酶?18家族341?165，319?330，41?330

圖3 幾丁質(zhì)酶模塊位置Fig.3 Motif pattern of the predicted chitinase

運用SOPMA軟件http:∥www.expasy.org/tools/#translate預(yù)測SJ-05幾丁質(zhì)酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)，表明該蛋白含約30.66%的α-螺旋，8.60%的β-折疊，18.62%的延伸鏈，42.12%的不規(guī)則卷曲。該基因編碼的蛋白主要由α-螺旋和不規(guī)則卷曲構(gòu)成，而β-折疊和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中。在SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析，得到該蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖，見圖4。

圖4 球孢白僵菌SJ-05幾丁質(zhì)酶蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模Fig.4 The 3D structure of the chitinase predicted by Swiss-model

2.3 SJ-05幾丁質(zhì)酶相似性及分子進化

將球孢白僵菌SJ-05幾丁質(zhì)酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源比對，SJ-05與已報道的4株白僵菌屬菌株、2株綠僵菌屬菌株、1株木霉屬菌株、1株鏈霉菌屬菌株和2株蘇云金桿菌的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列相似性為99.7%～25.9%，相似性最高的菌株為Bb0062(AAN41259.1)。SJ-05與4株白僵菌屬菌株的相似性為99.7%～98.3%，與2株綠僵菌屬菌株的相似性為80.3%和79.1%，與1株木霉屬04-001菌株的相似性為77.1%，與1株鏈霉菌屬e14菌株的相似性為76.1%，與2株蘇云金桿菌菌株的相似性最低，分別為26.4%和25.9%。相似性比對見圖5。

利用ClustalX2.0和MEG3.1軟件對SJ-05及已選的幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列建立的系統(tǒng)進化樹見圖6。

3 結(jié)論與討論

彭仁旺等從球孢白僵菌中純化的幾丁質(zhì)酶分子量分別為32.39 ku和52 ku[11-12]；方衛(wèi)國等克隆了球孢白僵菌的兩個幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1和Bbchit2，推測分子量分別為33ku左右和46.3ku[13-14]，王定鋒等從茶卷葉蛾球孢白僵菌菌株中克隆的幾丁質(zhì)酶基因，分子量約為36.78 ku[15]。采自內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗地區(qū)沙棘木蠹蛾白僵菌中克隆及推測的幾丁質(zhì)酶基因分子量為36.924 ku，可見，白僵菌菌株間幾丁質(zhì)酶基因的分子量有一定的差異，控制的酶也有一定差異。哪些酶活性更高有待進一步分析研究。

圖5 幾丁質(zhì)酶基因所推導(dǎo)的氨基酸序列與其他幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的相似性比較Fig.5 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of chitinase gene and its homologues

球孢白僵菌中存在多種幾丁質(zhì)酶，在穿透寄主體壁過程中的作用可能也各不相同，因此有必要從昆蟲病原真菌中克隆更多的幾丁質(zhì)酶基因，用遺傳轉(zhuǎn)化等手段驗證它們在侵染寄主過程中各自的作用[16]。除此之外，有研究表明，利用基因工程在昆蟲病原真菌中超量表達幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建高毒力菌株，可以有效地增強菌株的毒力[17]；但也有證據(jù)表明單一過量表達幾丁質(zhì)酶基因并不會增強昆蟲病原真菌的毒力[18]，因此，對白僵菌其他酶類的克隆研究也非常重要，應(yīng)用多種酶活力來評價白僵菌菌株對寄主昆蟲的侵染力。從本研究獲得的球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因與已發(fā)表的幾丁質(zhì)酶基因的相似性比較來看，與球孢白僵菌菌株JYBb201-11的核苷酸序列相似性高達99%，與球孢白僵菌菌株Bb0062(AAN41259.1)的氨基酸序列相似性最高，為99.71%。研究幾丁質(zhì)酶基因有助于揭示幾丁質(zhì)酶在侵染寄主過程中的重要作用，推測其與殺蟲毒力存在的相關(guān)性[19]。

圖6 幾丁質(zhì)酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列的進化樹比較Fig.6 Phylogenetic relationships of the deduced amino acid sequences of chitinase gene and its homologues

[1] 楊奮勇,許勝利,王瑛凱,等.狗獾控制沙棘木蠹蛾的初步調(diào)查[J].中國森林病蟲,2007,26(1): 42-43.

[2] 呂丁丁,李增智,王成樹.蟲生真菌分子致病機理及基因工程改造研究進展[J].微生物學(xué)通報,2008,35(3): 443-449.

[3] Rajasekhar Pinnamaneni,Kalidas P,Sambasiva Rao K R S.Cloning and expression ofBbchit1gene ofBeauveriabassiana[J].The Open Entomology Journal,2010,4: 30-35.

[4] Askary H,Benhamou N,Brodeur J.Ultrastructural and cytochemical characterization of aphid invasion by the hyphomyceteVerticilliumlecanii[J].Journal of Invertebrate Pathology,1999,74: 1-13.

[5] Roberta A C,Walquria A.Boophilusmicroplusinfection byBeauveriaamorphaandBeauveriabassianaof subtilisin-like proteases and chitinases[J].Current Microbiology,2005,50: 257-261.

[6] Sohail S Q,George G K.Addition of exogenous carbon and nitrogen sources to aphid exuviae modulates synthesis of proteases and chitinase by germinating conidia ofBeauveriabassiana[J].Archives of Microbiology,2008,189: 589-596.

[7] Kramer K J,Muthukrishnana S.Insect chitinases: molecular biology and potential use as biopesticide[J].Insect Biochemistry Molecular Biology,1997,27: 887-900.

[8] St Leger R J,Joshi L,Bidochka M J,et al.Characterization and ultrastructural localization of chitinases fromMetarhiziumanisopliae,M.flavoviride,andBeauveriabassianaduring fungal invasion of host (Manducasexta) cuticle[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,162: 907-912.

[9] Ding X F,Gopalakrishnana B,Johnson L B,et al.Insect resistant of transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene[J].Transgenic Research,1998,7: 77-84.

[10]Khemika Songjang,Tawee Donchai,Paranya Chaiyawat,et al.Cloning and expression of chitinase gene isolated from insect pathogenic fungi,BeauveriabassianainEscherichiacoli[J].Chiang Mai Journal of Science[J].2006,33(3): 347 - 355.

[11]彭仁旺,黃秀梨.球孢白僵菌胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶的分離純化與性質(zhì)[J].微生物學(xué)報,1995,35(6): 472-432.

[12]彭仁旺,管考梅,黃秀梨.球孢白僵菌兩種胞外幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)和純化[J].微生物學(xué)報,1996,36(2): 103-108.

[13]方衛(wèi)國,肖月華,冷波,等.一種新的球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶Bbchit的純化和基因克隆[C]∥首屆中國青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集,北京: 2002.

[14]方衛(wèi)國.昆蟲病原真菌降解寄主體壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重組菌株的獲得[D].重慶: 西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[15]王定鋒,曾明森,王慶森,等.茶卷葉蛾寄生真菌球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因的克隆與序列分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,26(4): 507-512.

[16]甄偉,杜立新,曹偉平,等.球孢白僵菌HFW-05幾丁質(zhì)酶基因的克隆與序列分析[J].華北農(nóng)學(xué)報,2010,25(1): 36-39.

[17]Fang W,Leng B,Xiao Y,et al.Cloning ofBeauveriabassianachitinase gene Bbchit1and its application to improve fungal strain virulence[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(1): 363-370.

[18]Screen S E,Hu Gang,St leger R J.Transformants ofMetarhiziumanisopliaesf.anisopliaeoverexpressing chitinase fromMetarhiziumanisopliaesf.acridumshow early induction of native chitinase but are not altered in pathogenicity toManducasexta[J].Journal of Invertebrate Pathology,2001,78(4): 260-266.

[19]王艷君,楊謙.來源于Chaetomiumcupreum的幾丁質(zhì)酶chi58基因克隆及特性分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,36(6): 43-47.

CloningandsequenceanalysisofchitinasegenefromBeauveriabassianaSJ-05

Yang Fan1, Liu Chunlai1, Duan Liqing2

(1.InstituteofPlantProtection,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China;2.CollegeofAgronomy,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010019，China)

The chitinase plays an important role in the infection of entomogenous fungus to its host insects.Chitinase gene was amplified and cloned fromBeauveriabassianaSJ-05 isolated from cadaver ofHolcocerushippophaecoluslarvae in the Jungar Banner,Inner Mongolia,and recombinant plasmid pMD19-T/chit was constructed.The results showed thatBbchitgene was 1047 bp in size and encoded 348 amino acids.The molecular weight and theoretical isoelectric point were 36.924 ku and 5.94,respectively.The deduced amino acid ofB.bassianaSJ-05 chitinase gene shared 99.71% homology with that ofB.bassianaBb0062.

Beauveriabassiana; chitinase gene; gene cloning; sequence analysis

2013-02-21

：2013-12-12

國家林業(yè)局“948”項目(2006-04-29)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.013

* 通信作者 E-mail: duanlq2013@163.com