孟建玉, 汪漢成, 賈蒙驁, 曹 毅, 商勝華*, 趙 陽(yáng)

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴陽(yáng) 550081; 2. 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 南京 210019)

貴州省煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的抗藥性

孟建玉1, 汪漢成1, 賈蒙驁1, 曹 毅1, 商勝華1*, 趙 陽(yáng)2

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴陽(yáng) 550081; 2. 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 南京 210019)

為了明確貴州地區(qū)煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的抗藥性水平,從貴州省12個(gè)市、縣采集黑脛病病株,經(jīng)分離純化鑒定,獲得98株黑脛病菌株,采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)甲霜靈的敏感性。結(jié)果表明,采自不同地區(qū)的菌株對(duì)甲霜靈的敏感性差異較大,各供試菌株的EC50值分布范圍為0.419 2～20.486 1 μg/mL；各地區(qū)平均EC50在0.551 9～10.986 0 μg/mL之間；最低抗藥性水平為1.00,最高抗藥性水平為48.87,相差48.87倍,各地區(qū)平均抗藥性水平在1.32～26.21之間。遵義、興仁、貴定、赫章和興義有抗甲霜靈菌株出現(xiàn),除遵義部分菌株的抗性水平表現(xiàn)為高抗外,其余菌株對(duì)甲霜靈產(chǎn)生的抗性均處于中抗水平。

煙草黑脛病菌； 甲霜靈； 抗藥性

煙草黑脛病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的世界性煙草主要病害,在我國(guó)除東北煙區(qū)零星發(fā)生外,其他煙區(qū)均有發(fā)生[1],目前主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。甲霜靈(metalaxyl)系列殺菌劑是防治煙草黑脛病的主要有效藥劑,但由于該類藥劑屬于特異性位點(diǎn)抑制劑,對(duì)病原菌的作用位點(diǎn)單一,長(zhǎng)期使用容易使病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性,導(dǎo)致防治效果下降[2-3]。Shew[4-5]發(fā)現(xiàn)隨著甲霜靈使用年限增加,ED50逐年升高,在0～3年中分別為0.3、0.4、0.7和1.2 μg/mL,證明連續(xù)使用甲霜靈會(huì)降低黑脛病菌對(duì)藥劑的敏感性,即抗藥性增加。Ferrin等[6]發(fā)現(xiàn)原始敏感菌系在甲霜靈用量為1 μg/mL時(shí)孢子囊形成就受到強(qiáng)烈抑制,而抗甲霜靈菌系在1、10和100 μg/mL用藥量下都不受抑制。在國(guó)內(nèi),由于生產(chǎn)上使用農(nóng)藥種類較單一,云南、安徽、四川等地的煙草黑脛病菌已對(duì)甲霜靈產(chǎn)生了抗性,為達(dá)防治目標(biāo)必須加大用藥量[7-9]。貴州是我國(guó)重要的煙葉產(chǎn)地,一旦黑脛病菌普遍對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗性,將對(duì)該地區(qū)的煙葉產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。目前關(guān)于貴州煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的抗性水平尚未明確,為此,本研究對(duì)貴州不同地區(qū)的煙草黑脛病菌進(jìn)行了抗藥性檢測(cè),以期為指導(dǎo)煙草黑脛病的防治及田間病菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及藥劑

供試菌株：分別從貴州省的遵義、興仁、貴定、赫章、興義、大方、務(wù)川、黔西、貞豐、金沙、凱里、織金12個(gè)市縣采集患煙草黑脛病的煙株,保留患病的莖稈部分,在室內(nèi)對(duì)其病原菌進(jìn)行分離、純化,于常溫下試管保存?zhèn)溆肹10]。共獲得各地?zé)煵莺诿劜【?8株。

供試藥劑：98%甲霜靈(metalaxyl)原藥,由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基

燕麥瓊脂培養(yǎng)基：參考鄭小波[10]的方法。稱取燕麥片100 g,加入2 000 mL去離子水,在60 ℃恒溫水浴鍋中加熱1 h后,用4層紗布過(guò)濾去渣,濾液用去離子水定容至2 000 mL,將其倒入全自動(dòng)培養(yǎng)基制備機(jī),加入瓊脂粉36 g,121 ℃滅菌30 min,然后用全自動(dòng)平皿分裝機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行平板分裝。

含藥燕麥瓊脂培養(yǎng)基配制：先將98%甲霜靈以丙酮為溶劑配成濃度為10 000 μg/mL的母液,置4 ℃冰箱中備用。測(cè)定時(shí)根據(jù)燕麥瓊脂培養(yǎng)基的用量,吸取一定量的藥劑母液,加入熔化并冷卻至60 ℃的培養(yǎng)基中,配成含甲霜靈最終有效濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5和5 μg/mL的系列含藥培養(yǎng)基。

1.3 敏感性測(cè)定方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[11]。將供試菌株接種于燕麥瓊脂平板上,28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后,用無(wú)菌打孔器切取直徑為5 mm的菌餅,將菌餅正面朝下分別移到含甲霜靈濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5和5 mg/L的燕麥瓊脂平板中央,以不含藥平板為空白對(duì)照, 28 ℃恒溫下暗培養(yǎng),5 d后測(cè)量各處理的菌落直徑,計(jì)算藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。抑制率(%)=[1-(藥劑處理的菌落直徑-5)/(空白對(duì)照的菌落直徑-5)]×100。每處理重復(fù)3次。

用各處理藥劑濃度的對(duì)數(shù)值和菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算出甲霜靈對(duì)各參試菌株的抑制中濃度EC50[9]。抗性水平=供試菌株EC50/ 敏感菌株EC50,由于自然界中很難采集到未施藥的敏感對(duì)照菌株,所以本文將所測(cè)菌株中最敏感菌株的EC50(0.4192 μg/mL)作為敏感基線[12-13]?？剐员硇蛣澐郑好舾?EC50≤5.0 μg/mL；中抗,5.0 μg/mL10.0 μg/mL。根據(jù)抗性表型將供試菌株劃分為敏感性菌株和抗性菌株。再根據(jù)抗性菌株在群體中出現(xiàn)的頻率計(jì)算出抗性菌株頻率。某地抗性菌株頻率(%)=某地抗性菌株數(shù)/該地供試菌株數(shù)×100[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性

貴州省不同煙草種植地區(qū)黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性差異很大。甲霜靈對(duì)所有供試菌株的EC50分布范圍為0.419 2～20.486 1 μg/mL,平均EC50為3.378 9 μg/mL。最大EC50為20.486 1 μg/mL(Y=4.555 9+0.338 7X,r=0.980 1),菌株來(lái)源于遵義；最小EC50為0.419 2 μg/mL(Y=5.460 6+1.219 8X,r=0.955 2),菌株來(lái)源于貴定,最大EC50和最小EC50之間相差48.87倍(圖1)。各地區(qū)平均EC50在0.551 9～10.986 0 μg/mL之間,織金菌株的平均EC50為0.551 9 μg/mL,遵義菌株的平均EC50為10.986 0 μg/mL,其他各地區(qū)介于這兩個(gè)地區(qū)之間(表1)。

圖1 貴州省煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性分布

2.2 煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的抗性水平

貴州省各地區(qū)供試黑脛病菌對(duì)甲霜靈的平均抗性水平在1.32～26.21之間,平均抗性水平最低的為織金,最高的為遵義(圖2)。供試的98個(gè)菌株中對(duì)甲霜靈最低的抗性水平為1.00,最高抗性水平為48.87(表2),相差48.87倍。其中,遵義的抗性水平在14.49～48.87之間,興仁的抗性水平在1.79～22.04之間,貴定的抗性水平在1.00～19.95,赫章的抗性水平在4.51～16.26之間,興義的抗性水平在3.68～12.02之間,大方的抗性水平在1.04～10.51之間,務(wù)川的抗性水平在1.34～6.24之間,黔西的抗性水平在1.63～6.68之間,貞豐的抗性水平在3.50～4.89之間,金沙的抗性水平在1.22～4.66之間,凱里的抗性水平在2.81～3.72之間,織金的抗性水平為1.32。其中,抗性水平最低的菌株來(lái)源于貴定,抗性水平最高的菌株來(lái)源于遵義(表2)。

表1貴州省不同地區(qū)煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性比較

Table1ComparisonofthesensitivityofP.parasiticacollectedfromdifferentdistrictsinGuizhouProvincetometalaxyl

地區(qū)District菌株數(shù)No．ofisolatesEC50分布范圍/μg·mL-1EC50EC50平均值/μg·mL-1AverageEC50遵義Zunyi76．0744～20．486110．9860興仁Xingren410．7514～9．24073．6452貴定Guiding60．4192～8．36422．9625赫章Hezhang61．8899～6．81693．6632興義Xingyi61．5426～5．03713．0603大方Dafang60．4361～4．40211．6551務(wù)川Wuchuan70．5631～2．85891．4228黔西Qianxi70．6844～2．80171．6026貞豐Zhenfeng41．4689～2．05111．7299金沙Jinsha40．5134～1．95391．0264凱里Kaili31．1781～1．56121．3257織金Zhijin10．5519～0．55190．5519

圖2 貴州省不同地區(qū)煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的平均抗性水平

2.3 不同地區(qū)抗性菌株頻率分布

貴州省各地區(qū)抗性菌株頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,大方、務(wù)川、黔西、貞豐、金沙、凱里、織金的煙草黑脛病菌株未對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗性,其余各地區(qū)均出現(xiàn)了一定比例抗性菌株,其中以遵義的抗性菌株頻率最高,達(dá)100%,其次是興仁的抗性菌株頻率為21.95%,貴定、赫章和興義的抗性菌株頻率均為16.67%。興仁、貴定、赫章、興義大部分菌株對(duì)甲霜靈仍表現(xiàn)為敏感,只有少部分的菌株產(chǎn)生了中抗；遵義的所有供試菌株均對(duì)甲霜靈產(chǎn)生了抗性,呈現(xiàn)為中抗或高抗,其抗性頻率分別為57.14%和42.86%(表2)。

表2貴州省不同地區(qū)煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的抗性頻率

Table2ResistancefrequencyofP.parasiticacollectedfromdifferentdistrictsinGuizhouProvincetometalaxyl

地區(qū)District抗性菌株No．ofresistantisolates最低抗性水平Lowestresistancelevel最高抗性水平Highestresistancelevel抗性頻率/%Resistancefrequency不同抗性水平的菌株頻率/%Frequencyofisolateswithdifferentresistancelevels敏感Sensitive中抗Middle高抗High遵義Zunyi714．4948．87 1000．0057．1442．86興仁Xingren91．7922．0421．9578．0521．950．00貴定Guiding11．0019．9516．6783．3316．670．00赫章Hezhang14．5116．2616．6783．3316．670．00興義Xingyi13．6812．0216．6783．3316．670．00大方Dafang01．0410．510．00 1000．000．00務(wù)川Wuchuan01．346．240．00 1000．000．00黔西Qianxi01．636．680．00 1000．000．00貞豐Zhenfeng03．504．890．00 1000．000．00金沙Jinsha01．224．660．00 1000．000．00凱里Kaili02．813．720．00 1000．000．00織金Zhijin01．321．320．00 1000．000．00

3 討論

隨著甲霜靈在防治煙草黑脛病上的大量使用,其抗性已成為生產(chǎn)上一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。為弄清貴州煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈是否產(chǎn)生抗藥性,從貴州12個(gè)市縣采集了98株煙草黑脛病菌,對(duì)其抗藥性進(jìn)行了檢測(cè)。因?yàn)榧姿`在貴州煙草生產(chǎn)上使用了許多年,采集從未用藥的標(biāo)準(zhǔn)野生敏感菌株很難,本文敏感基線的確定參照文獻(xiàn)[12-13]的方法,將供試菌株中最敏感菌株的EC50作為敏感基線。研究發(fā)現(xiàn),貴州省不同地區(qū)的煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性差異很大,來(lái)自不同地區(qū)的菌株中敏感、中抗和高抗菌株的比例有較大差異,其原因可能與菌株來(lái)源、各地用藥水平及防治歷史有關(guān)。在抗性水平測(cè)定中,遵義、興仁、貴定、赫章和興義有抗甲霜靈菌株出現(xiàn),其中遵義地區(qū)的抗性菌株頻率最高,達(dá)到100%,且部分菌株已達(dá)到高抗水平；其次為興義地區(qū),其抗性頻率為21.95%。這是因?yàn)樽窳x和興仁為貴州省種植煙草的老煙區(qū),煙農(nóng)在防治黑脛病時(shí)習(xí)慣于連年使用甲霜靈,且加大了用藥次數(shù)和劑量,給病原菌產(chǎn)生抗藥性創(chuàng)造了極為有利的條件。這也間接說(shuō)明不同地區(qū)由于用藥程度上存在差別,其抗藥性就存在明顯差別。

根據(jù)抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果,目前對(duì)于貴州省而言,敏感菌株仍是優(yōu)勢(shì)類群,說(shuō)明貴州省的煙草黑脛病菌尚未大面積對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗性,對(duì)大部分植煙區(qū)只要加強(qiáng)農(nóng)業(yè)栽培措施的管理,定期做好抗性監(jiān)測(cè)工作,注意甲霜靈與其他農(nóng)藥的交替和輪換使用,甲霜靈仍可作為防治黑脛病的有效藥劑。但對(duì)遵義、興仁、貴定、赫章等已表現(xiàn)中抗、高抗的地區(qū)使用甲霜靈防治黑脛病存在較大的抗性風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)盡可能減少甲霜靈使用頻次及用量或者直接停止使用,建議生產(chǎn)上使用烯酰嗎啉進(jìn)行防治[3, 15],最大限度地阻止抗性群體的發(fā)展蔓延。

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ResistanceofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaetometalaxylinGuizhouProvince

Meng Jianyu1, Wang Hancheng1, Jia Meng’ao1, Cao Yi1, Shang Shenghua1, Zhao Yang2

(1.GuizhouTobaccoResearchInstitute,Guiyang550081,China;2.ChinaTobaccoJiangsuIndustrialCo.,Ltd.,Nanjing210019,China)

In order to investigate the resistance level ofPhytophthoraparasiticavar.nicotianaeto metalaxyl in Guizhou Province, samples of tobacco black shank were collected in major tobacco growing areas in 12 cities and counties of the province, and 98P.parasiticastrains were isolated. The sensitivity of these strains to metalaxyl was determined by mycelial growth rate. The results showed that the sensitivity ofP.parasiticafrom different districts differed significantly, with EC50values ranged from 0.419 2 to 20.486 1 μg/mL and the average EC50value between 0.551 9 and 10.986 0 μg/mL. The lowest and the highest resistance level were 1.00 and 48.87, respectively. The average resistance level ofP.parasiticafrom different districts was between 1.32 and 26.21. The resistant isolates existed in Zunyi, Xingren, Guiding, Hezhang and Xingyi regions. The resistance levels of some strains in Zunyi were high, but the other strains were at the middle resistance level.

Phytophthoraparasiticavar.nicotianae； metalaxyl； fungicide resistance

2013-10-29

：2014-03-20

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2011]2336號(hào)，黔科合J字[2012]2257號(hào));貴州省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(200916，201022)

S 435.72

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.032

* 通信作者 E-mail: mengjy0417@163.com